多電極アレイ上でのマウススパイラル神経節ニューロン外植片の培養

要約

出典:Hahnewald, S., et al Spiral Ganglion Neuron Explant Culture and Electrophysiology on Multi Electrode Arrays. J. Vis. Exp. (2016)

このビデオは、内耳から螺旋神経節外植片を分離し、それらを多電極アレイ上でコルチ器官と共培養するプロセスを示しています。螺旋神経節は慎重に抽出され、より小さな組織切片または外植片に切片化されます。これらの外植片は、多電極アレイの活性領域で培養され、ニューロンプロセスの伸長を促進します。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 実験用の溶液を準備する

1. 細胞外マトリックス(ECM)コーティング溶液を調製します(材料表を参照):ECMミックスを氷上で解凍します。ECMミックスを塩基性培地(神経栄養因子またはウシ胎児血清(FBS)を含まない)で1:10に希釈し、氷上に保存します。
2. 培地を調製します(材料表を参照):FBSまたは脳由来神経栄養因子(BDNF)を含まない神経基礎培地のストックを準備します。細胞培養物に加える直前に、新しいFBS(10%)とBDNF(5 ng/ml)をニューロ基礎培地に添加します。
3. 細胞外溶液を調製します(材料表を参照)。

2. MEAの洗浄と滅菌

>注:実験に使用されたMEAには、長方形のグリッドに配置された68個の電極が含まれています(図1E)。各電極のサイズは40 x 40 μm²で、中心から中心まで200 μmの間隔があります。電極はプラチナ製です。電極は、酸化インジウムスズで作られた回路によって対応する接点に接続されています。この回路は、SU-8の5μm層によって絶縁されています。プロバイダーの詳細については、マテリアル テーブルを参照してください。これらの実験には、他の MEA レイアウトが適している場合があります。

1. 新しいMEAの場合:70%エタノールに30秒間浸してすすぎ、蒸留水で30秒間洗浄します。
2. MEAを層流フードで30分間乾燥させます。
3. 各MEAを個々の滅菌ペトリ皿(35 mm x 10 mm)に入れ、ホイルで密封します。MEAは使用するまで保管できます。
4. 使用済みMEAの場合:1 mlの酵素溶液(材料表を参照)O / Nが入ったペトリ皿(35 mm x 10 mm)でMEAをRTのオービタルシェーカーでインキュベートし、生物学的物質を除去します。次に、手順 2.1.
   と同様に続行します 手記： MEAは、先端がゴムで覆われた鉗子を使用して注意して取り扱ってください。

3. 培養実験のためのMEAの準備

1. シーリングホイルを取り外し、実験全体にわたってMEAをペトリ皿(35 mm x 10 mm)に残します。
2. 1.1で調製した溶液でMEAをコーティングする:冷たかった200μLのピペットチップ(-20°Cで保存)を使用して、各MEAに50μlのコーティング溶液をピペットで移動させ、電極領域全体を覆います。
3. MEAがRTで30分から1時間
コーティングできるようにします。
4. ピペットを使用してコーティング溶液を取り除きます。10% FBSと5ng/ml BDNFを添加した培地100 μlを適液で塗布し、組織に播種するまで室温に置いておきます。
5. コーティングされたMEAを含む2つのシャーレを大きなシャーレ(94 mm x 16 mm)に入れ、1.5 mlのリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)を含む3番目の小さなシャーレを追加して加湿します
   手記： PBSを含む小さなペトリ皿(ステップ3.5)を追加することは、培地の蒸発を大幅に最小限に抑えるために重要です。

4. 螺旋神経節解剖

>注:肉眼的解剖は層流フードの外側で行うことができます(ステップ4.1から4.4)。細かい解剖のためには、無菌状態(層流フード)が必須です(ステップ4.5から)。

1. 動物(5〜7日齢のマウス)を、事前の麻酔なしで斬首して安楽死させます。
2. 70%エタノールを噴霧してヘッドを滅菌します。
3. 頭を持って、矢状線に沿って鋭利な/鋭いはさみで皮膚と頭蓋骨の間の接続を切ります。
4. 頭蓋骨を矢状に切り、鋭利な/鈍いハサミを使用して脳を切除します。
5. 頭蓋骨から側頭骨を切り取り、滅菌した氷冷ハンクスバランスソルトソリューション(HBSS)が入ったシャーレに入れます。
6. 解剖顕微鏡を使用して、細い鉗子を使用して鼓膜を解剖し、内耳を分離します。
7. 細い鉗子を使用して、蝸牛の骨を取り除きます。
8. らせん状靭帯と血管筋(SV)を鉗子で保持し、SVを基部から頂点までゆっくりとほどくことにより、らせん靭帯と血管筋(SV)を一緒に除去
します
9. コルチ(OC)、SGおよびモディオールスの器官を分離します(図1A-C)。
10. SGとOCの基底部を鉗子で保持し、OCを基部から頂点までゆっくりと巻き戻すことにより、OCをSGとmodiolusから分離します。
11. 鉗子とマイクロメスを使用して、モディオルスにまだ付着しているらせん神経節(図1D)から側方外植片(直径200〜500μm)を切り取ります。

>5. MEAsでのスパイラルガングリオン外植片培養

1. 100 μlの培地で調製したMEA上の電極の隣に、2つのらせん状神経節外植片を配置します。
2. コルチの臓器を電極領域から約5mm離して配置します。.
3. 鉗子を使用して、組織に損傷を与えないようにしながら、外植片とコルチの臓器をMEAに固定します。
4. MEAをインキュベーターに慎重に入れ、37°C、5%_CO2で培養します。翌日、外植片がMEAに付着していることを目視検査します.
   手記：外植片がO / Nを付着していない場合、今後数日間でO/Nが付着することはめったにありません。OCは、栄養/神経栄養サポートのために培養物に隣接して配置されます。
5. 10% FBSおよびBDNFを含む培地100 μlを毎日5日間連続して加えます。
6. 6日目に、10%FBSと5ng/ml BDNFを含む培地2mlを加え、さらに13日間培養します。

結果

図 1.細胞培養の準備。(A)解剖したばかりのマウスの内耳。白い破線は蝸牛の位置を示し、黒い破線は前庭領域を示します。(B)蝸牛骨壁を切除した後のマウスの内耳。蝸牛の回転は白い破線で示されます。(C)解剖後の渦状神経節(SG)と螺旋状神経節、コルチ(OC)の器官、血管筋(SV)と螺旋靭帯が示されています。(D)SGおよびOC解剖およびSG外植片調製の概略図。(E)本研究で用いた多電極アレイの図。再符号化電極は、中央の長方形のグリッドに編成され、2.2 mm²の面積を占めます。4 接地電極と側面接点が示されています。(F)培養プロトコルの概略図。録音は18日目に行われます。(G)1日目、6日目、18日目に培養中でモニターしたMEA上のSG外植片の代表的な写真(明視野画像)とスキーム。スケールバー = 400 μm。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
神経基礎媒体	インビトゲン	21103-049	24ml(25ml用)
ヘープス	インビトゲン	15630から080	250 μl (25 ml用)
グルタマックス	インビトゲン	35050-061	250 μl (25 ml用)
B27	インビトゲン	17504-044	500 μl (25 ml用)
FBSの	ギブコ	10099-141	10%(25ml用)
BDNFの	R&Dシステム	248-BD-025/CF	最終5 ng / ml(25 mlの場合)
NaCl			145mM
KClの			4mM
MgCl2			1mM
CaCl2			2mM
ヘープス			5mM
Na-ピルビン酸			2mM
グルコース			5mM
PBSの	インビトゲン	10010023
BSAの	シグマ	A4503-50Gの	2%
トリトンX-100	シグマ	X100	0.01パーセント
ペトリ皿35 mm	フーバーラボ	7.627 102
ペトリ皿94 mm	フーバーラボ	7.633 180
デュモン #5 ピンセット	WPIの	14098
デュモン #55 ピンセット	WPIの	14099
酵素溶液:Terg-a-Zyme	シグマ	Z273287-11KG
細胞外マトリックス(ECM)ミックス:Matrigel TM	コーニング	356230
MEA電極	クワネバイオサイエンス		(スイス・ローザンヌ)

さん の の