マウスアストロサイトのニューロンへのダイレクトニューロンリプログラミング

要約

出典: Hersbach, B. A. et al., Isolation and Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes. J. Vis. Exp. (2022)

このビデオでは、変換因子をニューロンに発現するアストロサイトの直接的なリプログラミングを紹介しています。形質転換因子は、アストロサイトからニューロンへの変換を促進する分子イベントのカスケードを引き起こします。このプロセスは、ニューロン分化培地を通じて特定の薬剤とサプリメントを供給することによってさらにサポートされます。

プロトコル

1. リプログラミングのためのアストロサイトの播種

注:次の手順は、安全レベル1(SL1)の生物学的安全キャビネットの下で実行する必要があります。

1. ポリD-リジンコーティングされたガラスカバースリップを、以前に培養フラスコを調製したのと同じ方法で、24ウェルプレートを調製します。必要なプレート数を決定するために、アストロサイトが24ウェルプレートでウェルあたり5〜5.5 x 10⁴細胞の密度でプレーティングされていることを考慮してください。通常、出生後2日目(P2)マウスから6つの脊髄を単離すると、約1 x 10⁶細胞が得られます。
2. 培養アストロサイトを含むT25培養フラスコから培地を吸引し、1倍リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1回洗浄します。0.05 mLの0.05 mLのトリプシン/エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を加えて培養フラスコからアストロサイトを分離し、37°Cで5分間インキュベートします。フラスコの側面を軽くたたいて培養フラスコの表面から細胞を放出し、10倍の倍率で明視野顕微鏡で剥離を確認します。
3. 2.5 mLのアストロサイト培養培地でトリプシン処理を停止し、細胞懸濁液を15 mLチューブに回収します。300 x gで5分間遠心分離し、上清を吸引し、細胞を1 mLのアストロサイト培養培地に再懸濁します。血球計算盤または自動細胞計数システムを使用して細胞濃度を計算します。
4. 細胞数に基づいて、細胞懸濁液を新鮮なアストロサイト培地で希釈し、1 mLあたり1〜1.1 x 105細胞の溶液を得ます。上皮成長因子(EGF)と塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)を1因子あたり10 ng/mLで培地に補充します。5-5.5 x 10⁴細胞に相当する500 μLの細胞懸濁液を、あらかじめ調製した24ウェルプレートの各ウェルに加え、37°Cおよび5% CO₂で細胞を培養します。

2. 転写因子の強制発現

注:プロトコルを進める前に、実験を適切に設計することが不可欠です。特に、リプログラミングにはネガティブコントロール、つまりリプログラミングファクターが発現しない条件を常に含めることが重要です。例えば、リプログラミング因子とレポーター(例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)、DsRed)にcDNAを運ぶベクターを使用する場合、ネガティブコントロールはレポーターのみを運ぶ同じベクターで表されます。異なるレポーターを運ぶ複数の要因を表現する場合、ネガティブコントロールはそれに応じて調整する必要があります。

1. めっきの翌日、24ウェルプレートを検査し、細胞がカバーガラスに付着していることを確認します。
2. 実験目的と利用可能なリソースに基づいて、リプログラミング因子の強制発現は、ウイルス形質導入(ステップ2.3を参照)またはDNAトランスフェクション(ステップ2.4を参照)によって達成できます><。 注:レトロウイルスまたはレンチウイルスの使用には、政府当局の承認が必要であり、安全レベル2(SL2)の研究所内の生物学的安全キャビネットの下で行う必要があります。
3. 遺伝情報を運ぶレトロウイルスまたはレンチウイルスを細胞に形質導入することにより、アストロサイトを再プログラムし、以下に説明するように目的のリプログラミング因子を発現します。
   1. 1 μLの細胞懸濁液をアストロサイト培地に直接添加することにより、1 x 10^{10-10 x 10 12} particles/mLの高ウイルス力価で細胞を形質導入します。これにより、高い感染率が保証されます。実験の目的に応じて、ウイルス粒子を含むアストロサイト培地で細胞を37°Cで24〜36時間培養してから、セクション3に進みます
      注:導入遺伝子の発現を促進するために、異なるプロモーターを使用することができます(代表的な結果も参照)。構成的プロモーター{例えば、サイトメガロウイルス(CMV)、ニワトリβ-アクチン(CAG))}は、誘導性プロモーターよりも早く導入遺伝子の発現を誘導する。しかし、どちらのタイプのプロモータータイプも、細胞をニューロンに再プログラムするために成功裏に使用されています。
4. DNAプラスミドは、以下に説明するようにDNAトランスフェクションを介してアストロサイトにも導入できます
   手記：これは、SL1用に承認された生物学的安全キャビネットの下で行うことができます。
   1. トランスフェクションの前に、トランスフェクション試薬、目的のコンストラクトのプラスミドDNA、新鮮なアストロサイト培地、および血清還元培地を入手してください(材料の表を参照)。24ウェルプレートの各ウェルに300 μLの血清還元培地が必要であることを考慮して、必要な血清還元培地(材料表を参照)を計算します。50 mLチューブに適量の血清還元培地を加え、37°Cに温めます。
   2. 血清減少培地が温かい場合は、すべてのウェルからアストロサイト培地を吸引し、50 mLチューブに回収します。採取したアストロサイト培地を0.45 μMシリンジフィルターでろ過し、剥離した細胞を除去します。
   3. 濾過した培地に等量の新鮮なアストロサイト培地を添加して、ウェルあたり1 mLのアストロサイト培地を添加するのに十分な溶液を得ます。インキュベーター内のアストロサイト馴化培地を使用まで37°Cに保ちます(ステップ2.4.9).
      手記：培地は、培養物の生存率をサポートするいくつかの分泌因子を含んでいるため、再利用されます。
   4. 予熱した血清還元培地300 μLを各ウェルに加え、24ウェルプレートをインキュベーターに戻します。
   5. DNAと血清還元培地からなる溶液Aを調製します。各ウェルについて、合計0.6 μgのDNAを使用し、50 μLの血清還元培地に添加します。溶液Aは使用するまで室温で保存します.
      注:通常、条件ごとに技術的なトリプリケートが考慮されます。したがって、3.5反応に十分な混合物(例えば、175μLの血清還元培地で希釈した全DNA2.1μg)を調製し、24ウェルプレートの3ウェルをトランスフェクションするのに十分な材料を確保します。
   6. トランスフェクション試薬と血清還元培地からなる溶液Bを調製します。各ウェルについて、0.75 μLのトランスフェクション試薬を50 μLの血清還元培地に加えます。この溶液はすべてのトランスフェクション条件に共通するため、トランスフェクション間のばらつきを減らすために、バルクで調製してください。
   7. 溶液Bを室温で5分間インキュベートし、溶液Bを溶液Aに1滴ずつ1:1の比率で加え、穏やかに混合します。渦巻きにしないでください。溶液A+Bを室温で20〜30分間インキュベートします。
   8. すべてのトランスフェクション条件について、ステップ2.4.5-2.4.7を繰り返します。20〜30分後、溶液A+Bを各ウェルに一滴ずつ加え、最終容量を100 μLにします。プレートを静かに振って、細胞を37°Cのインキュベーターに4時間戻します。
   9. 4時間後、トランスフェクション培地を取り出し、ステップ2.4.3で調製した予熱したアストロサイト馴化培地1 mLを加えます。セクション3に進む前に、実験の目的に応じて、細胞を36〜48時間維持します。

>3. アストロサイトのリプログラミング(7日間の解析)

1. 49 mLの塩基性培地に1 mLのB27サプリメントを加えて、ニューロン分化培地を調製します。24-48時間後、細胞が形質導入されたかトランスフェクションされたか(それぞれステップ2.3および2.4を参照)に応じて、アストロサイト培地をウェルあたり1 mLのニューロン分化培地と交換し、細胞を37°Cおよび9%CO_で培養します
   注:9%_CO2インキュベーターが利用できない場合は、細胞を5%_CO2に保つこともできます。しかし、ニューロンのリプログラミングは、これらの条件下ではより効率的です。
2. オプション:リプログラミング効率を高めるために、アストロサイト培地を分化培地に置き換えるときは、ニューロン分化培地にフォルスコリン(最終濃度30μM)とドルソモルフィン(最終濃度1μM)を補充します。フォルスコリンとドルソモルフィンで細胞を治療することを選択した場合は、最初の治療の2日後にドルソモルフィンの2回目の投与を提供します。.この2回目の処理を培地に直接加えます。
3. マウスのアストロサイトのニューロン細胞への直接再プログラミングは、通常、培地を交換してから7日以内に行われます(図1)。したがって、ニューロンのリプログラミングの開始から7日後に、下流の分析のために細胞を固定または収集します。

結果

図 1: アストロサイト培養とリプログラミングの概要。(ア)アストロサイトからニューロンへの直接変換のタイムライン。各黒い線は、プロトコルの重要なステップを表しています。(B)培養7日後の培養脊髄由来アストロサイトの代表的な明視野画像。写真は、明視野顕微鏡と10倍対物レンズを使用して撮影しました。(C)24ウェルプレートにウェルあたり5.5×104細胞の密度で再プレーティングした1日後の脊髄アストロサイトの代表的な明視野像。画像は、明視野顕微鏡と10倍対物レンズを使用して撮影されました。スケールバーは100μmを表し、(D)βIII浴槽、Sox9、GFAPトリプル染色の免疫蛍光像を、培養純度を実証するためにプレーティングの1日後にアストロサイト上で固定します。細胞を4%パラホルムアルデヒドに10分間固定し、1x PBSで2回洗浄しました。細胞は、1x PBS溶液中の3% BSA、0.5% Tri...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.05%トリプシン/ EDTA	ライフテクノロジー	25300054
B27	ライフテクノロジー	17504044
bFGFの	ライフテクノロジー	13256029
DMEM/F12	ライフテクノロジー	21331020
ドルソモルフィン	シグマ・アルドリッチ	P5499
EGFの	ライフテクノロジー	PHG0311
ウシ胎児血清	パンバイオテクノロジー	P30-3302
フォルスコリン	シグマ・アルドリッチ	F6886
リポフェクタミン 2000 (トランスフェクション試薬)	サーモフィッシャー	猫#11668019
OptiMEM – GlutaMAX(減血清培地)	サーモフィッシャー	カタログ番号# 51985-026
ペニシリン/ストレプトマイシン	ライフテクノロジー	15140122
ポリ-D-リジン	シグマ・アルドリッチ	P1149

サプリメント 型