聴覚ニューロンを可視化するためのくさび脳スライスの準備

要約

出典:Fischl, M. J. et al., In Vivo Neuronal Circuit Connectivityを模倣するためのIn Vitro Wedge Slice Preparation.J. Vis. Exp.(2020年)

このビデオは、実験室の設定でくさび形の脳スライスを準備するプロセスを示しています。ビブラートームを使用して、マウスの脳からくさび形のスライスをさまざまな厚さで作成します。このスライスには、太い方の端にある聴覚神経根が含まれており、細い方の端には聴覚関連のニューロンが配置されています。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 刺激のための無傷の聴覚神経根による脳の除去

>注:これらの実験のマウスは、C57BL/6Jバックグラウンド上のChAT-IRES-CreトランスジェニックマウスとtdTomatoレポーターマウス(Ai14)を交配することによって得られました。組織学および電気生理学に用いたマウスは、聴力発現後(P14-P23)であり、これはマウスではP12程度であった。台形体の腹側核(VNTB)でtdTomatoを発現するニューロンは、このマウス系統では以前に内側乏子牛(MOC)ニューロンとして特徴付けられていました。

1. 安楽死させ(_CO2窒息など)、承認された制度的手続きを使用して動物を斬首します。
2. かみそりの刃を使用して、鼻から首の後ろまでの頭蓋骨の正中線で皮膚を切ります。皮膚をはがして頭蓋骨を露出させます。
3. 小さなハサミを使用して、頭蓋骨の基部(脊髄近くの尾側端)から鼻に向かって、正中線を通じて頭蓋骨を切開します。
4. ラムダ縫合糸で、頭蓋骨の正中線から両側の耳に向かって外側に切り込みを入れます。頭蓋骨をはがして脳を露出させます。
5. 吻側の端から始めて、小さな実験用へらまたは鈍い鉗子を使用して、脳を頭蓋骨からそっと持ち上げます。視神経を切断し、腹面を露出させて脳を優しく後方に動かし続けます。
6. 三叉神経を脳幹の腹側表面近くの細い鉗子でつまむことにより、三叉神経を切断します。
   手記：前庭蝸牛神経はこのすぐ下にあり、最終的な刺激のために無傷である必要があるため、これを慎重に行ってください。
7. 冷たいスライス溶液で満たされたガラスのペトリ皿に準備を置きます。皿を解剖顕微鏡の下に置きます。カルボゲンでやさしく泡
立てます。
8. 顔面神経を脳幹の近くでトリミングし、前庭蝸牛神経を露出させます。
9. 細い鉗子を使用して、前庭蝸牛神経が頭蓋骨からできるだけ出る孔に先端を押し込み、神経をつまんで切断し、神経根を脳幹に付着させたままにします。これを反対側で繰り返します。
10. 両方の神経根が自由になったら、台形体の近くの脳幹の腹側表面から髄膜と血管系を取り除きます。
11. 可能であれば残りの脊髄を保存するように注意しながら、残りの脳神経と結合組織をつまむことにより、頭蓋骨から脳を完全に解放します。

2. ステージ上の頭脳をブロックして取り付ける(磁気ディスク)

1. 視交叉のレベルで脳をブロックすることにより、脳の表面をステージに固定する準備をします。
   1. 腹面を上にして、鈍器を使用して脳を安定させ、脊髄を優しく固定し、次のステップで脳が傾かないようにします。
   2. 視交叉のレベルでは、開いた鉗子を使用して、脳から皿の底まで挿入することにより、脳をブロックするための平面を作成します。鉗子を垂直から約20°の角度で挿入し、先端が脳尾の背側表面から視交叉に出るようにします。
   3. かみそりの刃を使用して鉗子に沿って切ります。
2. 脳をステージの表面に接着します。
   1. 脳を支えるために、4%寒天の小さなブロック(~^1cm3)を準備します。
   2. ステージに接着剤を少し垂らし、長方形に広げて、脳と寒天ブロックの両方を接着できるようにします。
   3. 鉗子を使用して、脳を慎重に持ち上げ、ペーパータオルの端を使用して余分な液体を軽くたたきます。ブロックされた表面を接着剤の上に置くと、スライス中に腹側表面がブレードに向けられます。
   4. 寒天ブロックを脳の背側表面にそっと押し付けて、スライス中にブロックを支え、適切な脳の位置(つまり、角度)を確保します。

>3. 脳をスライスしてくさびスライスを作成します

>注:太い側に蝸牛神経根、細い側に内側の蝸牛(MOC)ニューロンと台形体の内側核(MNTB)があるビブラトームを使用して脳スライスを準備します。

1. ブレインを取り付けた磁気ディスクをステージベースに置き、ブレインの腹面をブレードに向けてスライスチャンバーに置きます。
2. チャンバーを氷冷スライス溶液で満たし、カルボゲンで泡
立てます。
3. ブレードを溶液に下げ、スライスを関心領域に対して尾側に切り、スライスが対称であることを確認します。スライスが非対称に見える場合は、ステージを少し傾けて対称性を得ます。
   手記：0.05〜0.10 mm / sのブレード速度は、健康なスライスを切断するのに効果的であり、動物の年齢や脳の領域によって異なる場合があります。
4. スライスが対称になったら、ステージを ~15° (ステージベースの約 3 つの同心円リングに相当) 片側にシフトします。
   手記：ステージを、スライスに保持したい聴神経根から遠ざけます。
5. 片側の聴神経根が表面に近くなり、反対側の表面に顔面神経が見えるまで、慎重にスライスを続けます。
6. ステージを元の位置に15°戻します。
7. ブレードを組織から離し、ステージベースを90°回転させて、薄い側の横端がブレードに向くようにします。ブレードを数百ミクロン下げてから、ブレードをゆっくりと組織の端に近づけます。ブレードが横方向の端に触れるまで、これを繰り返します。ブレードをスライスの薄いエッジの所望の厚さまで下げ、ここではさらに200ミクロン下げます。
   手記：結果として得られるスライスは、パッチクランプが行われる側の台形体(VNTB)の腹側核のレベルで、理想的には~300mmの厚さです。
8. ブレードを組織から離し、腹面がそれに面するようにステージベースを回転させます。
9. くさびスライスの吻側表面を指定するカットを行います。スライスを尾側表面を下にしてインターフェースペーパー(1 cm²)に移します。スライスをインキュベーションチャンバーまたは他の適切なインキュベーション装置に移動して回収します(35°Cで30分).
   手記：顔面神経は、吻側表面のスライスの両半球に見えるはずです(図1Bを参照)。

結果

図1:ウェッジスライスの概略図とサンプル画像(A)内側オリボコクレアフィードバック回路の概略図。青矢印はMOCニューロンへの求心性上行経路を示し、黒矢印はMOCニューロンから外有毛細胞(OHC)の基部への下降フィードバック経路を示します。(B)太い側に聴神経根(ANR)と蝸牛核(破線の輪郭)のラベルが付いたくさび形スライスの明視野画像。アスタリスクは、MOCニューロンがウェッジスライスの薄い側でのパッチクランプの対象となる台形体の腹側核のおおよその位置を示しています。黒い破線は顔面神経を示しており、吻側表面のスライスの両半球に見られます。IHC - 内有毛細胞、GBC - 球状ふさふさした細胞、SPN - 上傍傍核、MNTB - 台形体の内側核、VNTB - 台形体の腹側核、LSO - 外側上オリーブ。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
実験準備
寒天、粉末	フィッシャーサイエンティフィック	BP1423500	ビブラトーム切片化中に脳組織を安定させるために使用される4%寒天ブロック
AlexaFluorヒドラジド488	インビトゲン	A10436 (英語)	MOCニューロンパッチの成功を確認するための内部溶液中の蛍光色素
分析天びん	ジェネセス・サイエンティフィック(Intramalls)	AV114	化学薬品の計量
両刃のカミソリの刃	テッド・ペラ	121から6	ビブラートームカッティングブレード
キヌレン酸(5g)	シグマ・アルドリッチ	K3375-5G	スライスACSF添加剤は、パッチクランプのための組織の健康を改善するために、解剖およびスライス中のニューロン活動を減らすために使用されます
pHメーター	フィッシャーサイエンティフィック(Intramalls)	13-620-451	溶液pHテスター
プラスチックシャーレ 直径100mm×20mm	フィッシャーサイエンティフィック(Intramalls)	12-556-002	4%寒天培地
攪拌ホットプレート	フィッシャーサイエンティフィック(Intramalls)	11-500-150	4%寒天培地の加熱
解剖とスライス
ビオシチン	シグマ・アルドリッチ	B4261-250MG	軸索トレーシングに使用される化学物質(ストレプトアビジン488に結合)
解剖顕微鏡	アムスコープ	SM-10億	脳摘出時の精密解剖に
デュモン #5 鉗子	ファインサイエンスツール	11252から20	細い鉗子解剖ツール
エコノミーピンセット #3	WPIの	501976	鉗子解剖ツール
ガラスシャーレ 直径150mm×高さ15mm	フィッシャーサイエンティフィック(Intramalls)	08-747E	解剖皿
界面紙(203×254mm PCTEメンブレン 10um)	トーマス・サイエンティフィック	1220823	スライスインキュベーション/ビオシチンアプリケーション
ライカ VT1200S ビブラートーム	ライカ	1491200S001	ウェッジスライスセクショニング用のビブラート
メイヨーハサミ	ロボズ	RS-6872	解剖ツール
片刃炭素鋼ブレード	フィッシャーサイエンティフィック(Intramalls)	12〜640	解剖用のカミソリ刃
試料ディスク、配向	ライカ	14048142068	再現可能な傾斜のための専用ビブラトームステージ
スプーンラ	フィッシャーサイ	14-375-10	解剖ツール
瞬間接着剤	ニューエッグ	15187	ビブラトームステージに組織を接着するために使用
バンナススプリングシザーズ	ファインサイエンスツール	91500から09	解剖ツール