聴覚ニューロンを可視化するためのくさび脳スライスの準備

Abstract

出典:Fischl, M. J. et al., In Vivo Neuronal Circuit Connectivityを模倣するためのIn Vitro Wedge Slice Preparation.J. Vis. Exp.(2020年)

このビデオは、実験室の設定でくさび形の脳スライスを準備するプロセスを示しています。ビブラートームを使用して、マウスの脳からくさび形のスライスをさまざまな厚さで作成します。このスライスには、太い方の端にある聴覚神経根が含まれており、細い方の端には聴覚関連のニューロンが配置されています。

Protocol

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 刺激のための無傷の聴覚神経根による脳の除去

>注:これらの実験のマウスは、C57BL/6Jバックグラウンド上のChAT-IRES-CreトランスジェニックマウスとtdTomatoレポーターマウス(Ai14)を交配することによって得られました。組織学および電気生理学に用いたマウスは、聴力発現後(P14-P23)であり、これはマウスではP12程度であった。台形体の腹側核(VNTB)でtdTomatoを発現するニューロンは、このマウス系統では以前に内側乏子牛(MOC)ニューロンとして特徴付けられていました。

1. 安楽死させ(_CO2窒息など)、承認された制度的手続きを使用して動物を斬首します。
2. かみそりの刃を使用して、鼻から首の後ろまでの頭蓋骨の正中線で皮膚を切ります。皮膚をはがして頭蓋骨を露出させます。
3. 小さなハサミを使用して、頭蓋骨の基部(脊髄近くの尾側端)から鼻に向かって、正中線を通じて頭蓋骨を切開します。
4. ラムダ縫合糸で、頭蓋骨の正中線から両側の耳に向かって外側に切り込みを入れます。頭蓋骨をはがして脳を露出させます。
5. 吻側の....

Results

図1:ウェッジスライスの概略図とサンプル画像(A)内側オリボコクレアフィードバック回路の概略図。青矢印はMOCニューロンへの求心性上行経路を示し、黒矢印はMOCニューロンから外有毛細胞(OHC)の基部への下降フィードバック経路を示します。(B)太い側に聴神経根(ANR)と蝸牛核(破線の輪郭)のラベルが付いたくさび形スライスの明視野画像。アスタリスクは、MOCニューロンがウェッジスライスの薄い側でのパッチクランプの対象となる台形体の腹側核のおおよその位置を示しています。黒い破線は顔面神経を示しており、吻側表面のスライスの両半球に見られます。IHC - 内有毛細胞、GBC - 球状ふさふさした細胞、SPN - 上傍傍核、MNTB - 台形体の内側核、VNTB - 台形体の腹側核、LSO - 外側上オリーブ。

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
実験準備
寒天、粉末	フィッシャーサイエンティフィック	BP1423500	ビブラトーム切片化中に脳組織を安定させるために使用される4%寒天ブロック
AlexaFluorヒドラジド488	インビトゲン	A10436 (英語)	MOCニューロンパッチの成功を確認するための内部溶液中の蛍光色素
分析天びん	ジェネセス・サイエンティフィック(Intramalls)	AV114	化学薬品の計量
両刃のカミソリの刃	テッド・ペラ	121から6	ビブラートームカッティングブレード
キヌレン酸(5g)	シグマ・アルドリッチ	K3375-5G	スライスACSF添加剤は、パッチクランプのための組織の健康を改善するために、解剖およびスライス中のニューロン活動を減らすために使用されます
pHメーター	フィッシャーサイエンティフィック(Intramalls)	13-620-451	溶液pHテスター
プラスチックシャーレ 直径100mm×20mm	フィッシャーサイエンティフィック(Intramalls)	12-556-002	4%寒天培地
攪拌ホットプレート	フィッシャーサイエンティフィック(Intramalls)	11-500-150	4%寒天培地の加熱
解剖とスライス
ビオシチン	シグマ・アルドリッチ	B4261-250MG	軸索トレーシングに使用される化学物質(ストレプトアビジン488に結合)
解剖顕微鏡	アムスコープ	SM-10億	脳摘出時の精密解剖に
デュモン #5 鉗子	ファインサイエンスツール	11252から20	細い鉗子解剖ツール
エコノミーピンセット #3	WPIの	501976	鉗子解剖ツール
ガラスシャーレ 直径150mm×高さ15mm	フィッシャーサイエンティフィック(Intramalls)	08-747E	解剖皿
界面紙(203×254mm PCTEメンブレン 10um)	トーマス・サイエンティフィック	1220823	スライスインキュベーション/ビオシチンアプリケーション
ライカ VT1200S ビブラートーム	ライカ	1491200S001	ウェッジスライスセクショニング用のビブラート
メイヨーハサミ	ロボズ	RS-6872	解剖ツール
片刃炭素鋼ブレード	フィッシャーサイエンティフィック(Intramalls)	12〜640	解剖用のカミソリ刃
試料ディスク、配向	ライカ	14048142068	再現可能な傾斜のための専用ビブラトームステージ
スプーンラ	フィッシャーサイ	14-375-10	解剖ツール
瞬間接着剤	ニューエッグ	15187	ビブラトームステージに組織を接着するために使用
バンナススプリングシザーズ	ファインサイエンスツール	91500から09	解剖ツール