金ナノロッドを用いた神経細胞分化の促進

要約

出典:Paviolo., et al. 金ナノロッド支援神経細胞の光刺激。J. Vis. Exp.(2015年)。

このビデオは、神経細胞を金ナノロッドとレーザー光にさらすことにより、神経細胞の分化を促進する技術を示しています。これにより、βIII-チューブリンによって支持された細胞突起が形成されます。チューブリンと細胞核を落射蛍光顕微鏡で染色し観察すると、細胞の増殖が明らかになり、ナノロッドがニューロンの分化に有効であることが示されています。

プロトコル

1. NG108-15 神経細胞株の培養と分化

1. 細胞培養培地には、10%(w / v)のウシ胎児血清(FCS)、1%(w / v)L-グルタミン、1%(w / v)ペニシリン/ストレプトマイシン、および0.5%(w / v)アムホテリシンB.
   を含む滅菌ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)500 mLを調製します 注:サプリメントは分注し、-20°Cで保存し、必要な日に培地に加えることができます。細胞培養培地は、無菌状態で最大1ヶ月間冷蔵することができます。
2. 細胞分化培地として、1%(w/v)L-グルタミン、1%(w/v)ペニシリン/ストレプトマイシン、および0.5%(w/v)アムホテリシンBを含む50 mLの滅菌DMEMを調製します。
3. 加湿雰囲気(37°Cで5%CO2)のインキュベーターで、ポリスチレン製のT75フラスコ中の10 mLの細胞培養培地でNG108-15神経細胞を増殖させます。通常、各フラスコに1.5〜2個×10個の⁵個の細胞を播種して、3〜4日で準備します。細胞培養培地は2日ごとに交換してください.
   注:遺伝的浮動や変異を防ぐために、Passage 21より古い細胞を実験に使用しないでください。
4. 培養液が70〜80%コンフルエントになったら、温かみのある新鮮な細胞培養培地で培地を交換します。コンフルエントフラスコの底を軽くたたくことにより、細胞を機械的に取り外します。トリプシンは使用しないでください。
5. 細胞懸濁液を600 x gで5分間遠心分離し、細胞ペレットを2 mLの温かい細胞分化培地に再懸濁します。
6. 200 μlの細胞分化培地を含む組織培養ポリスチレン96ウェルプレートに2 ×^{10 4}細胞/cm²をシードします。実験を5%CO2 / 37°Cで1日間インキュベートします。
7. 2日目に3.2 ×^{10 9} - 4.2 ×^{10 10}粒子/mlの金ナノロッド(Au NR)溶液を10 10 mL追加し、さらに24時間インキュベートします。対照実験用の粒子を追加しないでください。
   注:代替コントロールとして、高分化ピーク吸収波長を有する金ナノ粒子(Au NP)を比較目的に用いることができ、より一貫した細胞挙動のためには、細胞密度を一定に保ち、細胞播種前にウェル表面を改変しないでください。

2. 神経突起伸長の強化

1. レーザーをシングルモード光ファイバー(開口数= 0.13)で結合し、ファイバーコネクタ(FCコネクタが便利で一般的に利用可能)で終端します。出力レーザーパワーを標準パワーメーターで測定します。最も効果的な結果を得るには、レーザーのピーク波長をNRのプラズモン共鳴ピークに一致させます。
2. NRインキュベーション後3日目に、FCコネクタをウェルに固定します。サンプルとコントロールをRTで1分間連続波で照射し、さまざまなレーザー出力に対応します。5% CO2 / 37°Cでさらに3日間培養を進行させ、レーザー照射を少なくとも3回の独立した測定で繰り返します。
   注:用途によって異なる照射時間やパルス周波数を選択する場合があります。
3. ビーム径とレーザー放射照度(W・cm-2)の観点からレーザーの特性評価を行います。
   1. 標準的なシングルモードファイバーの場合、NA = n・sinθ を使用します。ここで、n は使用中の媒体の屈折率、θ はファイバーから出る光の円錐の半角です (図 1A を参照)。三角法から、r = tanθ∙d、ここで、rはビーム半径、dはファイバーとサンプルの間の距離です。FCコネクタはウェルの直径と一致するため、d = 2.70 ± 0.20 mmの距離でサンプルを照らします。光は水(n = 1.33)で繊維から出て、r = tan(sin-1(NA/n))∙dになります。
   2. 後者の式を使用して、ターゲットでのレーザービーム半径、対応するビーム面積、および平均レーザー放射照度(レーザー出力をビーム面積で割ったもの)を計算します(図1Bの例のグラフを参照)。これらの値は、照らされた領域の平均放射照度を表します。
   3. 誤差伝播の一般理論を使用して測定の誤差を評価します。
      注:FCコネクタとサンプルの間の距離は、適切なソフトウェア(ImageJなど)を使用して、実験の配置と画像の後処理の写真で測定できます。
4. 5日目に、細胞分化培地を実験から取り出し、サンプルを3.7%(v / v)ホルムアルデヒド溶液で10分間固定し、次に0.1%(v / v)Triton X-100で細胞を20分間透過化します。
5. 3%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)をサンプルに60分間添加し、未反応のタンパク質結合部位をブロックします。サンプルを抗βIII-チューブリンについて一晩標識します(PBSに5 μg/mLに1%のBSAを添加)4°Cで
。
6. PBS中の1% BSA中に0.4-2 μg/mlの濃度を使用して、適切な二次抗体(例:TRITC(テトラメチルロダミン)標識抗マウスIgG抗体)を用いて、細胞を暗所で90分間インキュベートします。細胞核をDAPI(4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)(脱イオン水中0.1 μg/ml)で10分間標識します
   注:抗体の標識と濃度は、会社のプロトコルによって異なる場合があります。各染色段階の後、サンプルをPBSで5分間2回洗浄します。
7. 落射蛍光または共焦点顕微鏡による画像サンプルは、少なくとも20×対物レンズを使用して行います。顕微鏡フィルターは、二次抗体に応じて選択してください。DAPIフィルター(λEX = 358 nm、λEM = 488 nm)を選択して、細胞核を可視化します。
8. i)神経突起の最大長(神経突起の先端から細胞体の先頭までの長さを記録)、ii)神経細胞あたりの神経突起の数(細胞あたりのすべての神経突起を合計)、iii)神経突起を持つ細胞の割合(βIII-tubulinを発現する細胞の総数を、核が陽性で染色された細胞の総数で割る)を評価して、画像を分析します。

結果

図 1.光ファイバ実験装置(A)と、面積のレーザービームのレーザー出力の関数としての平均レーザー放射照度は0.4 mm2(B)に等しくなります。ビームパラメータは(A):ファイバーから出る光の最大円錐の半角(θ)、ビーム半径(r)、および光ファイバーとサンプルの間の距離(d)です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
auのNR	シグマ・アルドリッチ	716812
NG108-15	シグマ・アルドリッチ	8811230
DMEM	シグマ・アルドリッチ	D6546
FCSの	ライフテクノロジー	10100147
L-グルタミン	シグマ・アルドリッチ	G7513
ペニシリン/ストレプトマイシン	ライフテクノロジー	15140122
アムホテリシンB	ライフテクノロジー	15290018
ホルムアルデヒド	シグマ・アルドリッチ	F8775
トリトンX-100	BDHの	T8532
BSAの	シグマ・アルドリッチ	A2058(英語版)
抗βIII-チューブリン	プロメガ	G7121
TRITC標識抗マウスIgG抗体	シグマ・アルドリッチ	T5393
ダピ	インビトゲン	D1306
UV-Vis分光計	バリアン・メディカル・システムズ・インク	ケーリー50バイオ
ミニ遠心分離機	エッペンドルフ	ミニスピン
ソニックバス	ユニソニックス・オーストラリア	FPX10D(エフエフエックス10D)
細胞培養インキュベーター	ケンドロ	ヘラセル150
細胞培養用遠心分離機	ヘティヒ	ロトフィックス32A
レーザーダイオード	オプトテック	780nmシングルモードファイバー-結合LD
光ファイバー	ソーラブ	780馬力
パワーメーター	コヒーレント	レーザーチェック
イメージJ	http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html
エピ蛍光顕微鏡	Axon インスツルメンツ	ImageX-プレス5000A
PBSの
ポリスチレン96ウェルプレート
CO2
T75フラスコ