ゼブラフィッシュ胚からの初代網膜神経節細胞培養物の作製

要約

出典:Terzi, A., et al., ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development. J. Vis. Exp. (2021)

このビデオは、ゼブラフィッシュの胚から初代網膜神経節細胞を培養する方法を示しています。初期段階の胚は解剖を受けて眼を分離し、その後、眼は機械的に解離して網膜神経節細胞の懸濁液になります。この細胞懸濁液は、軸索の発達を促進するために接着性タンパク質でコーティングされたカバースリップ上で培養されます。

プロトコル

1. 溶液の準備

1. E2メディア(1x)
   1. 表1に示すすべての成分を組み合わせて、100x E2A(500 mL)、500x E2B(100 mL)、500x E2C(100 mL)溶液を調製します。オートクレーブE2A、E2B、E2Cソリューション。4°Cで保存してください。
   2. 1x E2培地の場合:100x E2Aを5 mL、500x E2Bを1 mL、500x E2Cを1 mL組み合わせます。滅菌水で容量を500mLにします。pHを7.0〜7.5に調整します。
   3. 1x E2培地50 mLを調製し、-20°Cで長期保存します。ただし、解凍時に降水が発生する可能性があります。原液を使用する前に、沈殿物が完全に溶解していることを確認してください。

>表1:ゼブラフィッシュ細胞培養用の1x E2培地の成分。

の の の

解決	コンポーネント	量	濃度
100X E2A(500mL)
	NaCl	43.8 グラム	1500 mM
	KClの	1.88 グラム	50 mM
	MgSO4	6グラム	100 mM
	KH2PO4	1.03 グラム	15 mM
	Na2HPO4	0.34グラム	5メートルメートル
500X E2B(100 mL)
	CaCl2	5.5グラム	500 mM
500X E2C(100 mL)
	NaHCO3	3グラム	350 mM
1X E2 (500 mL)
	100X E2A	5ミリリットル	1倍
	500X E2Bの	1 mL	1倍
	500X E2C	1 mL	1倍

2. E3メディア(1x)
   1. 表2に示すように、成分を1Lの滅菌水に溶解して、100倍ストックを作製します。ストックを滅菌水で希釈して、1x E3培地を作製します。
   2. 0.2%メチレンブルーを追加します。1x E3培地20 mLに、メチレンブルー40 μLを加えます。

表2:ゼブラフィッシュの胚を維持するための100x E3培地の成分。

の 名 名 % 名 名

コンポーネント	内容量(g)	100Xストック中の濃度(mM)
NaCl	29月22日	500
KClの	1.26	17
CaCl2 2H2O	4.85	33
MgSO4 7H2O	8.13	33

3. 80倍生理食塩水ストック溶液
   1. 表3に示すすべてのコンポーネントを組み合わせます。水を加えて100mLの溶液を作ります。すべての成分が溶解するまで混合します。溶液は4°Cで保存します。

>表3:ゼブラフィッシュ細胞培養培地用の80倍生理食塩水の成分。

名 名 名 名

コンポーネント	内容量(g)	在庫濃度(mM)
グルコース	1.44	80
ピルビン酸ナトリウム	0.44	40
CaCl2 2H2O	0.148	10
ヘープス	6.1	256

4. ゼブラフィッシュ細胞培養液(ZFCM+)
   1. 表 4 に示すすべての成分を組み合わせ、250 mL 培地を調製します。pHを7.5に調整します。0.22 μmフィルターを使用して媒体をろ過し、4°Cで保存します。

>表4:ゼブラフィッシュ細胞培養培地の成分と血清および抗生物質。

%

コンポーネント	内容量(mL)	ボリューム %
L-15ミディアム(フェノールレッド入り)	212.75	85.1
ウシ胎児血清(FBS)	5	2
ペニシリン/ストレプトマイシン	1	0.4
80倍生理食塩水	3.125	1.25
水	28.125	11月25日

2. ゼブラフィッシュ胚由来の初代網膜神経節細胞培養

>注:層流フードで手順2.1と2.2を実行します。

1. カバースリップの準備
   1. 各実験で4〜6枚の培養プレートを準備します。100%エタノールで保存された酸洗浄されたカバースリップ(22 x 22 mm角、厚さ0.16-0.19 mm)を使用してください。
   2. 鉗子を使用して保存容器からカバースリップを1枚取り出し、炎で残るエタノールを取り除きます。
   3. カバーガラスを35mmの培養皿内に斜めに置いて、完全に風乾します。
   4. Poly-D-Lysine(PDL)ワーキングソリューション(1x)を調製するには、ストック10倍(5 mg/mL)を滅菌水で希釈します。
   5. 0.5 mg/mL PDL100 μLを各カバーガラスの中央に塗布し、溶液が端に広がるのを避けます。
   6. PDLをカバーガラス上で室温(RT)で20〜30分間インキュベートします。PDLが乾かないように注意してください。
   7. PDLを0.5mLの滅菌水で3回洗浄します。プレートを完全に乾かします。
   8. ラミニンワーキングソリューション(1x)を調製するには、50倍ストック(1 mg/mL)を1x PBSで希釈します。
   9. PBS中の20μg/mLラミニン100μLを各カバースリップの中央に塗布し、溶液が端に広がるのを防ぎます。
   10. プレートを加湿インキュベーターで37°Cで2〜6時間インキュベー
   トします。
2. 胚解剖とRGCのプレーティング
   1. 35 mm組織培養皿4枚を調製して標識し、解剖当日に70%エタノール、「E2培地1」、「E2培地2」、「E2培地3」を4 mL充填します。皿は解剖するまで冷蔵庫に保管してください。
   2. ゼブラフィッシュの胚が受精後34時間(hpf)のときに、ラミニンでコーティングされた培養皿をインキュベーターから取り出し、0.5mLの1x PBSでカバーガラスを3回洗浄します。
   3. 最終洗浄後、各培養皿に4 mLのZFCM(+)培地を加え、プレートが乾燥しないようにします。
   4. 準備した培養皿を手順 2.2.1 から取得します。彼らをRTに平衡化させます。
   5. 4-6本のPCRチューブに15μLのZFCM(+)培地を充填します。4つの目からRGCを1つのカバースリップにメッキするためには、1本のチューブが必要です。
   6. インキュベーターからゼブラフィッシュの胚を取り出し、70%エタノールを含む35 mm組織培養皿に胚を5〜10秒間浸して滅菌します。
   7. トランスファーピペットを使用して、滅菌済みE2培地を含むE2培地1皿に胚を移し、余分なエタノールを洗浄します。
   8. 胚をE2 Media 2ディッシュに移し、鋭い鉗子で絨毛膜を取り除きます。
   9. 胚を最終的なE2 Media 3ディッシュに移し、解剖を行います。
   10. 細い鉗子を使用して、網膜を解剖します。
   11. 鉗子の1つで胚を卵黄の前方に配置して保持し、もう一方の鉗子で卵黄嚢の後方の尾を取り除きます。
   12. 鉗子で首をつかんで頭を脱がすと、脳と目がE2メディアに露出します。卵黄嚢を切ることは避けてください。
   13. 細い鉗子の先端で、2番目の鉗子で頭蓋組織を押さえながら、目を頭からそっと転がします。隣接する組織の破片から目を隔離してください。
   14. ZFCM(+)を含む以前に準備したチューブの1つに4つの目を移します。
   15. P20ピペットと黄色の先端で約45回ゆっくりと滴定し、細胞を解離します。気泡を避けてください。
   16. 解離したセルを持つZFCM(+)をカバースリップの中央に移します。追加のカバースリップについて、手順10〜12を繰り返します。
   ベンチ
   17. トップの22°Cの発泡スチロールラックで培養物を維持し、振動を吸収します。
   18. めっき後6-24時間でイメージングを行います。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
35mm培養皿	ザルシュテット	〒83-3900
塩化カルシウム二水和物	フィッシャーサイエンティフィック	C79-500
カバーガラス	コーニング	2850から22
使い捨てペトリ皿(100 x 15 mm)	VWRの	25384-094
ウシ胎児血清	サーモフィッシャーサイエンティフィック	26140087
グルコース	シグマ・アルディッチ	G7528
ヘープス	シグマ・アルディッチ	H4034-J
ラミニン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	23017-015
LeibovitzのL-15ミディアムフェノールレッドなし	ギブコ/フィッシャーサイエンティフィック	〒21-083-027
PBSの	ハイクロン/フィッシャーサイエンティフィック	SH3025601
ペニシリン/ストレプトマイシン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15140122
ポリ-D-リジン(PDL)	シグマ・アルディッチ	P7280
ピルビン酸ナトリウム	シグマ・アルディッチ	P5280
ステリトップ 0.22 μm フィルター	ミリポア	S2GPT05RE

の 型 型