血液由来多能性幹細胞からの神経細胞の生成

要約

出典:Becker-Kojić, Z. A., et al.GMフリーの血液由来ニューロン細胞の生成。J. Vis. Exp.(2021年)。

このビデオでは、血液由来多能性幹細胞(BD-PSC)から神経細胞を生成する技術を示しています。BD-PSCは、血液前駆細胞のリプログラミングによって得られます。未分化BD-PSCは、神経誘導培地と神経分化培地を用いて細胞培養基質被覆カバースリップ上で培養され、神経細胞の表現型を持つ細胞への分化が引き起こされます。

プロトコル

実験を行う際に倫理的な承認が得られました。

1. ヒト末梢血単核細胞(PBMNC)の単離

1. すべてのドナーが、機関のガイドラインに従って採血する前にインフォームドコンセントに署名していることを確認します。
2. 標準的なプロトコルに従って、訓練を受けた医療従事者が健康なドナーから30mLの血液を採取します。
3. 密度勾配媒体によりPBMNCを単離します。10 mLの培地と25 mLの1:1血液をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈し、300 x gで30分間遠心分離します。
4. ピペッティングにより、プラズマと密度勾配媒体の間の相間層を分離します。単離した細胞を5mLの滅菌PBSで洗浄し、300 x gで10分間遠心分離します。
5. カウントチャンバーを使用した標準的な方法で細胞数をカウントします。

2. PBMNC表面への抗体架橋によるヒトグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカー型糖タンパク質の活性化

1. 6 x 10⁶単核細胞(MNC)を15 mLチューブに入れ、細胞をヒトGPI結合膜タンパク質特異的抗体(30 μg/mL)と1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含むPBSで30分間インキュベートし、37°Cで抗体架橋を行います。
2. インキュベーション培地を、10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したIscoveの改変ダルベッコ培地に置き換えます。
3. 15mLのポリスチレンチューブで細胞を増殖させ、チューブを37°Cおよび5%CO₂のインキュベーターに8〜10日間(振とうせずに)入れます。5日目(D5)に、10%FBSを添加したIscoveの培地を各15mLチューブに追加して1〜2mL追加します。

>3. 新しく生成された脱分化細胞の選別

1. 自動セルカウンター(18 μL細胞懸濁液+2 μL蛍光色素)または計数チャンバー内で細胞をカウントします。
2. 培養細胞懸濁液(5-7 x 10⁶)を300 x gで10分間遠心分離し、得られた上清を滅菌パスツールピペットで吸引します。
3. 細胞ペレットを90 μLの予冷済みPBS pH 7.2、0.5% BSAおよび2 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)に再懸濁します。
4. CD45ポジティブナノサイズの磁気ビーズ(80μL)を細胞懸濁液に加え、氷上で15分間インキュベートします。
5. 2 mLのPBSバッファーを加えて細胞を洗浄し、300 x gで10分間遠心分離します。
6. 細胞を500 μLのPBSバッファーに再懸濁します。
7. 予冷したPBSバッファー500μLでカラムを洗浄し、磁場下に置きます。
8. 細胞懸濁液をカラムに置き、500 μL の PBS バッファー (2 回) と CD45 ネガティブ細胞を含む遠心流で洗浄します。1%BSAを添加したIscoveの培地でそれらを収集します。
9. 計数チャンバー内の細胞をカウントします。

4. 新しく生成された幹細胞の神経分化のための細胞培養皿の準備

1. 培養容器にポリ-L-オルニチンとラミニンをコーティングして、神経細胞を増殖させます。
2. ガラスカバースリップを4ウェルプレートに入れ、1:5希釈したポリ-L-オルニチン(0.1 mg/mLの二重蒸留水[ddH₂O])でddH₂Oにコーティングします。カバースリップを37°Cのインキュベーターに1時間入れます。その後、_ddH2Oで洗浄します。
3. ラミニン(0.5-2.0 mg / mL)をゆっくりと解凍し、カバーガラスの上部に加えます。.37°Cで2時間インキュベートします。
4. 49 mLのダルベッコ修飾イーグル培地/栄養混合物F-12(D-MEM / F12)、500 μLのN2サプリメント、400 μLの非必須アミノ酸(NEAA)、最終濃度20 ng / mLの塩基性線維芽細胞成長因子(FGF)溶液(100 μg / mLストック溶液から調製)、および最終濃度2 ng / mLのヘパリンからなる神経誘導培地N2を調製します。
5. ピペッティングで余分なラミニンを取り除き、神経細胞培地N2を培養皿に加えます。

5. 神経細胞の脱分化血液細胞の培養

1. BD由来のCD45陰性細胞をラミニン/オルニチン被覆ガラスカバースリップ上で、インキュベーター内の37°CおよびN2培地中の5%CO₂で2日間培養し、新たにBDが生成された細胞のニューロン分化を開始します。
2. さらに、48 mLの神経基礎培地、500 μLのL-グルタミン、1 mLのB27サプリメント、500 μLのNEAA、50 μLの組換えヒトグリア由来神経栄養因子(GDNF)、5 μg/250 μLのPBS/0.1% BSAおよび50 μLの組換えヒト脳由来神経栄養因子(BDNF)からなる神経分化培地で細胞をさらに培養します。μLのアスコルビン酸溶液2.9 g / 50 mLのPBS溶液。.プレートを37°Cおよび5%CO₂のインキュベーターに入れます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アルブミンフラクションV	ロス	T8444.4
AO/PI細胞生存率キット	バイオザイム	872045	Biozymは販売終了。Logos Biosystemsが製造した製品です。
アスコルビン酸2-リン酸セキマグネス	シグマ・アルドリッチ	A8960-5Gの
B27 セラムフリー 50x	フィッシャーサイエンティフィック(Gibco)	11530536
基本的なFGFソリューション	フィッシャーサイエンティフィック(Gibco)	10647225
バイオコール	メルクミリポア	L6115-BC	密度勾配媒体
BSAフラクV 7.5%	ギブコ	15260037
CD45マイクロビーズ	ミルテニー	〒130-045-801	ナノサイズの磁気ビーズ
細胞計数スライド Luna	バイオザイム	872010	Biozymは販売終了。Logos Biosystemsが製造した製品です。
D-MEM/F12	メルクミリポア	FG4815-BC
FBSの	メルクミリポア	S0115/1030Bシリーズ	中止。以下で入手可能: TMS-013-B
GDNF組換えヒト	フィッシャーサイエンティフィック(Gibco)	10679963
グルタマックス 100倍	ギブコ	35050038	L-グルタミン
ヘパリンナトリウム細胞	シグマ・アルドリッチ	H3149-50KUさん
ヒトBDNF	フィッシャーサイエンティフィック(Gibco)	11588836
イスコーブ (IMDM)	バイオクロム	FG0465
ラミニンマウス	フィッシャーサイエンティフィック(Gibco)	10267092
Luna FL 自動セルカウンター	バイオザイム	872040	Biozymは販売終了。Logos Biosystemsが製造した製品です。
MACSバッファ	ミルテニー	〒130-091-221
MEM NEAA 100xの	ギブコ	11140035
MiniMACS Trennsäulen	ミルテニー	〒130-042-201
Multiplatte Nunclon 4ウェル	フィッシャーサイエンティフィック	10507591
N2サプリメント100倍	フィッシャーサイエンティフィック(Gibco)	11520536
ニューロベースルミディアム	ギブコ	10888022
PBS滅菌済み	ロス	9143.2
ポリ-L-オルニチン	シグマ・アルドリッチ	4957-50ミリリットル

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