磁気プラットフォーム上での磁性ナノ粒子負荷ニューロンの成長と分化

要約

出典:Indech, G., et al. Fabrication of Magnetic Platforms for Micron-Scale Organization of Interconnected Neurons. J. Vis. Exp. (2021).

このビデオは、エンドサイトーシスを介してニューロン細胞が蛍光磁性ナノ粒子(MNP)を取り込む方法を示しています。これらのMNPをロードしたニューロンを磁気パターン化された基質上に成長させることで、細胞の接着が可能になります。培地を含む成長因子の添加は、ニューロン伸長の成長を助け、一方、基質の磁場は伸長の配向を指示する。

プロトコル

1. 細胞磁性ナノ粒子(MNP)の取り込み

1. 10%ウマ血清(HS)、5%ウシ胎児血清(FBS)、1%L-グルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、および0.2%アムホテリシンをロズウェルパークメディカルインスティテュート(RPMI)培地に添加し、PC12細胞培養用の基本的な増殖培地を調製し、0.22μmナイロンフィルターを使用してろ過します。
2. 1%ウマ血清(HS)、1%L-グルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、および0.2%アムホテリシンをRPMI培地に加え、PC12分化培地を調製し、0.22μmナイロンフィルターを使用してろ過します。
3. 10 mLの塩基性増殖培地を含む未処理の培養フラスコで細胞を増殖させ、10 mLの塩基性増殖培地を2〜3日ごとにフラスコに加え、8日後に細胞を継代培養します。
4. 細胞への取り込みには、細胞懸濁液を遠心チューブ内で200 × g、室温で8分間遠心分離し、上清を廃棄します。
5. 細胞を3 mLの新鮮な塩基性増殖培地に再懸濁します。再度、細胞懸濁液を200 × gおよび室温で5分間遠心分離し、上清を捨てます。細胞を3 mLの新鮮な分化培地に再懸濁します。
6. シリンジと針を使用して細胞を10回吸引し、細胞クラスターを分割します。血球計算盤を使用して細胞をカウントし、通常のコーティングされていない35mm皿に10個の⁶個の細胞を播種します。
7. 計算されたMNP懸濁液の量と分化媒体の量をディッシュに加えて、目的のMNP濃度と総量を達成します。細胞、MNP、および分化培地を混合します。5% CO₂加湿インキュベーターで皿を37°Cで24時間インキュベー
トします。
8. 細胞懸濁液を室温で200 × gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。細胞を新鮮な分化培地1 mLに再懸濁し、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。

2. 磁気プラットフォーム上での細胞分化と増殖

1. パターン化された基質を70%v / v /エタノールで洗浄し、基質をフード内の35mm培養皿に入れます。パターン化された基板の下に大きな磁石(~1500エルステッド)を1分間置き、最初に皿を上に動かして磁石から離して磁石を取り外し、次に磁石をフードから取り出します。紫外線を15分間点灯させます。
2. コラーゲン1型(ラットテール由来の溶液)を30%v/vエタノールで1:50に希釈することにより、基質をコラーゲン1型でコーティングします。35 mmディッシュをコーティングするには、30%エタノール1 mLに20 μLのコラーゲンを加えます。
3. 皿を溶液で覆い、すべての溶液が蒸発するまで待って、皿を数時間蓋をせずに放置します。滅菌済み1x PBSで3回洗浄します。スライドガラスは細胞播種の準備が整いました。
4. 細胞のMNP取り込み後に細胞を懸濁し、35 mmの培養皿に⁵個の細胞を10個播種し、2 mLの分化培地を添加します。培養物を5%CO2加湿インキュベーターで37°Cでインキュベートします。
5. 24時間後、1:100の新鮮なマウスβ-NGF(最終濃度50 ng / mL)を加えます。分化培地を更新し、2日ごとに新鮮なマウスβ-NGFを追加します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
6ウェル細胞培養プレート	隼	353846
96ウェル細胞培養プレート	SPLライフサイエンス	30096
アムホテリシンB溶液	バイオ産業	03-028-1B
ウシ血清アルブミン(BSA)	バイオ産業	03-010-1B
細胞・組織培養フラスコ	バイオフィル	TCF002250	75.0 cm^2 250 mL ベントキャップ、未処理
細胞培養皿	グライナーバイオワン	627から160	35ミリメートル
遠心分離管	バイオフィル	CFT021500	50ミリリットル
I.型コラーゲン	コーニング株式会社	354236	ラットテール、濃度範囲3-4 mg / mL
使い捨て針	KDLの		23グラム
使い捨てシリンジ	メディスポ	1160227640	10ミリリットル
ドナーウマ血清	バイオ産業	04-124-1A
エタノール 70%	ロミカル株式会社	19-009102から80
エタノールアブソリュート(脱水)	バイオラボ-化学	52505
ウシ胎児血清(FBS)	バイオ産業	04-127-1A
新鮮マウス β-NGF	ペプロテック	450から34
GMW Cフレーム電磁石。	バックリーシステムズ株式会社		3470、45ミリメートル
L-グルタミン	バイオ産業	03-020-1B
PBSの10倍	ハイラボ	BP507/1LD
PC12細胞株	ATCCの	CRL-1721
ペニシリン-ストレプトマイシンナイスタチン溶液	バイオ産業	03-032-1B
RPMI 1640 と L-グルタミン	バイオ産業	01-100-1A

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