$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. ヒト胚性幹細胞(hESC)適格基底膜マトリックスコーティングプレートの調製
- hESC認定の基底膜マトリックス(材料表を参照)溶液を4°Cで少なくとも2〜3時間または一晩ゆっくりと解凍して、ゲルの形成を防ぎます。
- 基底膜マトリックスコーティングプレートを調製するには、F12(DMEM+F12)を含む冷ダルベッコのModified Eagle Mediumでマトリックスを2%の最終濃度に希釈します。よく混合し、6ウェルプレートの各ウェルを1mLの希釈マトリックス溶液でコーティングします。
- 基底膜マトリックスコーティングプレートを室温(RT)で少なくとも3時間、または4°Cで一晩インキュベートします。
手記：基底膜マトリックスを含むプレートは、マトリックス溶液を除去してプレートを使用する前に、4°Cで1週間保存できます。
>2. コロニー型hESCのシングルセルhESC培養への適応
- 基底膜マトリックス上に増殖したコロニー型H9(WA09)hESCのフィーダーフリー培養物を継代するには、ウェルから培地を吸引します(図1A)。
- 1mLのDPBSで1回洗浄します。1ウェルあたり1 mLのディスパーゼ溶液(1 U/mL)を加え、37°Cで20分間インキュベー
トします。
- ディスパーゼを取り出し、細胞を2 mLのDMEM/F12で1回穏やかに洗浄し、培地を取り出し、各プレートに2 mLのDMEM/F12を加えます。
- ピペッティングで静かに上下させてコロニーを静かに取り除き、15 mLチューブに移します。
- ペレットを370 x gで2分間遠心分離し、培地を吸引します。
- 細胞ペレットを単一細胞に解離するには、2 mLの細胞剥離溶液(1倍濃度、材料表を参照)を加え、37°Cで10分間インキュベートします。
- 細胞を370 x gで2分間遠心分離し、剥離溶液を除去します。
- 新鮮なmTeSR1ヒトESC培地を添加し、ピペッティングで穏やかに上下させて細胞を単一細胞に解離します。
- コロニー型hESCをシングルセル型培養に適合させるには、10μMのROCK阻害剤を含む2 mLのmTeSR1に、基底膜マトリックスコーティングされた6ウェルプレートの各ウェルに約1.5〜2.0 x 106 hESCを24時間プレートします(図1A)。
- 24時間後、hESC培地をROCK阻害剤を含まない新しいmTeSR1と交換し、hESCをシングルセルタイプとして3日間増殖させます。媒体は毎日交換してください。
- 4日目に、培養物がほぼ100%のコンフルエントに達したら、剥離溶液で細胞を解離し、ステップ2.6.
の説明に従って再播種します。
手記：ROCK阻害剤は、シングルセル型hESC培養の最初の24時間における細胞生存率を改善します。
3. シングルセル型hESCのNPCへの分化(図2)
- NPCの分化を誘導するには、シングルセル型hESCを1 mLの剥離溶液(1x)で解離し、37°Cで10分間インキュベー
トします。
- 細胞を370 x gで2分間遠心分離し、剥離液上清を除去します。1 mLのDMEM/F12を加え、穏やかなピペッティングで細胞を再懸濁します。
- 10 μM ROCK阻害剤を含む2 mLのmTeSR1中の2 mLの5細胞/ウェルで、基底膜マトリックスコーティングされた6ウェルプレート上のプレートセル。
- 24時間後、培養培地を神経誘導培地(1%B27からビタミンAを除いたDMEM)に1μMのドルソモルフィンと5μMのSB431542を補充して交換します。
- 神経誘導の最初の4日間は隔日で媒体を交換し、その後は7日目に合流に達するまで毎日交換します(図2B)。
注:(1)ドルソモルフィンは、ALK2,3,6受容体を標的とすることによりBMP経路を阻害し、AMPKも阻害します。SB431542は、ALK5,7を標的とすることにより、TGFβ/アクチビン経路の阻害剤です。(2)同じプロトコルを別のESCライン(WA01)でテストしたところ、WA09と同様の結果が得られました。(3)私たちは一般的に基底膜マトリックスにマトリゲルを使用してきました。しかし、細胞をGeltrexで培養し、その後NPCに分化させることはでき、いくつかのNPCマーカーの発現が示すように、非常に類似した結果が得られます(図3D、E)。Geltrexは、Matregelと同じ方法で取り扱います(セクション1を参照)。
