成人ヒト脳からのフリーフローティングスライス培養物の調製

要約

出典:Fernandes, A., et al. Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain. J. Vis. Exp. (2019).

このビデオでは、成人の人間の脳からフリーフローティングスライス培養物を調製する技術を示しています。薄いスライスは、ビブラートームを使用して脳の切片から生成されます。次に、これらのスライスを成長因子を添加した培地に懸濁して、組織の生存率を維持します。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 材料の滅菌

>注:すべての材料と溶液は使用前に滅菌する必要があります。

1. すべての手術器具とビブラトームスライス材料(ナイフホルダー、検体ディスク、バッファートレイ)を乾式滅菌オーブンで180°Cで4時間滅菌します。
2. 温度に敏感な材料や機器をUVまたはガンマ線で滅菌します。
3. 培地と溶液をオートクレーブまたは0.22 μmの細孔膜によるろ過により滅菌します。

>2. 溶液の調製

1. 15-20 mLの輸送液を調製します:50% v/v ハンクス平衡塩溶液(HBSS)pH 7.4、出生後および成人の脳ニューロンの維持のための50%v/v基礎培地(材料の表)、10 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、3 mg/mLグルコース、および33 μg/mLゲンタマイシン.
   手記： 輸送溶液は、サンプル収集の少なくとも20分前に冷蔵および酸素化(カルボゲンガスでバブリング)する必要があります。
2. 300 mLのスライス溶液(HBSSに10 mM HEPESと3 mg / mLグルコースを添加)を調製し、冷凍庫で最初の結晶形成点まで冷却します。
3. 出生後および成人の脳ニューロンの維持のための基礎培地(材料表)に1% L-グルタミン誘導体(材料表)、神経培養用2%サプリメント(材料表)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、および0.25 μg/mLアムホテリシンBを添加した培養培地20 mLを調製します。

3. スライス装置のセットアップ

>注:このプロトコルは、手術室でのサンプル収集のロジスティクスのために、同僚の助けを借りて理想的に実行されます。

1. 塩を加えた氷のバケツで、スライス溶液をカルボゲン混合物の泡(95%O₂、5%CO₂)の下に少なくとも20分間置いてから使用してください。
2. 3%アガロースのブロック(約2 cm x 2 cm x 2 cm)を調製し、それをビブラトーム試料ディスクに瞬間接着して、スライス中に組織サンプルに追加の機械的支持体を作成します(図1E)。
3. スライス用のビブラトームを設定します:セクションの厚さを200μm、振動の周波数を100Hz、スライスの速度を0.5〜1.0mm/sの間で設定します。
4. ビブラトームバッファートレイをビブラトームベースにロックし、氷を追加して冷蔵保冷します スライス溶液とサンプルを受け取る前、およびスライス手順全体。

4. サンプルコレクション

>注:このプロトコルでは、ヒトの新皮質組織が手術室で収集され、実験室に運ばれました。

>注意:ヒトサンプルを取り扱う場合は、機関が定めた適切な安全プロトコルに従ってください。

輸送
1. 装置(図1C)は、以下から構成される輸送装置(図1C)を設置する:カルボゲン混合物を圧力/フラックスバルブに接続された圧力/フラックスバルブに接続された携帯用ガスボンベ、ガス出力を輸送容器に接続するシリコンチューブに接続され、輸送容器、通常はガス入力用の穴あき蓋付きの50mL円錐形遠心分離チューブ、 輸送溶液を含有するステップと、輸送中のサンプル冷却用の氷。
2. 検体(図1B)をすぐに回収してラボに輸送します。試料を低温輸送溶液(カルボゲン混合物で常に泡立てている)に浸します。

5. スライス

1. スライス溶液が入ったシャーレ(100 mm x 20 mm)に試料を移し、細かい手術器具を使用して、試料に残っている髄膜をできるだけ慎重に取り除きます(図1D)。
2. 実験デザインの特定の特性を持つスライスを作成するのに最適な試料の向きを選択し、No.24メスの刃を使用して、試料ディスクに接着するベースとなる平らな面を切り取ります。
3. 使い捨てのプラスチックスプーンと繊細な絵筆を使用して、ペトリ皿から破片を収集し、濾紙を使用して余分な溶液を乾燥させます(毛細管現象で乾燥させ、ティッシュの破片に紙で触れないようにします)。
4. 瞬間接着剤を使用して、組織がディスクにしっかりと接着し、アガロースブロックに接触するまで、組織をビブラトーム標本ディスクに取り付けます(図1E)。
5. ビブラトーム標本ディスク(組織が正しく付着している)を、プロセス全体で泡立つ必要があるスライス溶液で満たされたビブラトームバッファートレイに置きます。
6. かみそりの刃をしっかりと固定した状態でナイフホルダーを所定の位置にロックします。
7. スライス液は試験片とブレードの両方を覆う必要があり、その後でスライスを開始します(図1F)。
8. 試料を200μmのスライスにカットします.
   手記：一部のビブラトームは標本を自動的に切断しますが、プロセス中に綿密に観察し、スライス速度を微調整することで、より良いスライスを作成できる場合があります。最初の不規則なスライスを破棄します。
9. スライスをバッファートレイからスライス溶液でシャーレに移し、緩いエッジと余分な白質を約70%の皮質/30%の白質の割合でトリミングします。

>6. 文化

>注:この手順は、無菌環境下の層流キャビネットで実行します。

1. ウェルあたり600 μLの培地を(24ウェルプレートに)加え、スライスをプレーティングする前に、36°Cおよび5%CO₂で少なくとも20分間インキュベー
トします。
2. 絵筆を使用して、ウェルごとに1スライスをプレートします(図1G)。
3. プレートに未使用のウェルがある場合は、400μLの滅菌水で満たしてください。
4. プレートを36°C、5%CO₂.
   でインキュベートします。 手記：最初の培地交換は、スライスのサイズにもよりますが、めっき後8〜16時間で行う必要があります。
5. 以前に調製した培地10 mLに50 ng / mLの脳由来神経栄養因子(BDNF)を添加します。
   手記： 最初の8〜16時間の間に、スライスは600μLの培地でインキュベートされ、この段階での培地の消費が促進されるため、栄養の欠乏と酸性化を回避します。次のステップから、ウェルあたりの培地の容量を400 μLに調整します。
6. 各ウェルから333 μLのコンディショニング培地を取り出し、133 μLの新鮮なBDNF添加培地を加えます。
7. 24時間ごとに、コンディショニングされた培地の3分の1を新しいBDNF添加培地と交換することにより、培地交換のプロセスを繰り返します。

結果

図1:成人ヒトの皮質組織のサンプル収集、輸送、スライス、および培養。 手順は、薬剤耐性てんかん (A、B) の治療のために側頭葉切除術から皮質組織を採取する手術室から始まります。(C)組織片(n = 1)を直ちに氷冷酸素化輸送培地(下記参照)を含むチューブに移す。(D)研究室では、細い眼科用ピンセットを使用して髄膜を除去します。余分な液体を濾紙で乾燥させ、白質を下に向けてビブラトーム試料ディスクに断片を瞬間接着(E)します。(F)市販のシェービングカミソリを使用して、試料を200μmのスライスに切断し、繊細な絵筆で収集し、ペトリ皿に戻して余分な白質と緩い端(図示せず)をさらにトリミングしてから、(G)メッキを行い、フリーフローティング形式で培養します。(H)スライス培養物は数日間生存可能に保たれ、さまざまな実験プロトコルで使用できます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アガロース	シグマ・アルドリッチ	A9539の
過硫酸アンモニウム	シグマ	A3678-25Gの
アムホテリシンB	ギブコ	15290から018
B27	ギブコ	17504-044
BDNFの	シグマ・アルドリッチ	SRP3014
ウシ血清アルブミン	シグマ・アルドリッチ	A7906
グルコース	メルク	108337
グルタマックス	ギブコ	35050-061
ハンクスバランスソルト	シグマ・アルドリッチ	H1387-10X1L-1387-10X1L(英語版)
ヘペス	シグマ・アルドリッチ	H4034-J
神経基礎A	ギブコ	〒10888-022
PBSバッファーpH 7.2	ラボルクリン	590338
ペニシリン/ストレプトマイシン	シグマ・アルドリッチ	P4333
設備・資材
カルボゲン混合物	ホワイトマーチン		95%O2、5%CO2
CO2インキュベーター	ニューブランズウィックサイエンティフィック	CO-24	スライスのインキュベーション5%CO2、36ºC
プラスチックスプーン			デザートスプーンのサイズ
カミソリブレード	ビック		クロムプラチナ、ビブラトームによるスライスに使用
メスブレード	ベクトン・ディキンソン (BD)	ナンバー24	ティッシュのスライスに使用、同じサイズ以下を推奨
瞬間接着剤(ロックタイトスーパーボンダー)	ヘンケル		組成:エチルシアノアクリラート、2-プロペン酸、6,6'-ジ-terc-ブチル-2,2'-メチレノジ-p-クレゾール、ホモポリマー
ビブラトーム	ライカ	14047235612 - VT1000S

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