無血清培地を用いたラット脳からのミクログリアの単離と培養

要約

出典:Collins, H. Y., et al., Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium. J. Vis. Exp. (2018)

このビデオでは、ラットの脳からミクログリアを分離して培養する方法を紹介しています。これは、ミクログリアに特異的なモノクローナル抗体でコーティングされたプレートを使用して、ミクログリアを他の神経細胞および非神経細胞から分離することを伴います。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

>1. CD11b免疫パンニング用のシャーレを準備します(0日目)

>注:幼いラットの脳1〜2個ごとに1つのイムノパニング皿を準備します。

1. 15 cmのシャーレに50 mM Tris pH 9.5溶液25 mL
を加えます。
2. ヤギ抗マウスIgG(H+L鎖)をディッシュに加えると、最終濃度が6 μg/mLになります。均等に分散する渦巻き板。
3. 皿を37°Cで1〜3時間インキュベートします。
4. DPBS++(リン酸緩衝生理食塩水(PBS)とCa²⁺およびMg²⁺)で皿を3回すすぎ、1 μg/mLのOX42抗体を含むパニングバッファーの溶液で置き換えます。皿を平らな面に室温で一晩放置します。

>2. ティッシュコレクション(1日目)

>注:このプロトコルには~3〜4時間かかります。

1. 開始する前に、すべての溶液が無菌で、氷の上で冷やされていることを確認してください。すべての器具を氷の上で冷やし、使用前にエタノールで滅菌してください。
2. 適切な規制手順に従って、幼若の実験用ラットを二酸化炭素窒息により生贄にしてください。
   手記：あるいは、若い動物は致死量のケタミン/キシラジン(100〜200μLの24 mg / mLケタミン、2.4 mg / mLキシラジン)で犠牲にすることができます。.ケタミン/キシラジンは、動物が生後14日未満の場合に使用する必要があります。複数の動物を使用する場合は、1匹の動物から組織を抽出し、氷上で事前に冷却したDPBS⁺⁺に入れてから、次の動物に進みます。
3. 先に進む前に、後足をつまんで動物から完全に無反応であることを確認してください。
4. 271/2-G針を使用して、10〜30mLの氷冷灌流緩衝液で動物を経心的に灌流します。バッファーが透明になるまで
   手記： 灌流バッファーの量は、動物のサイズ/年齢によって異なります。
5. 灌流の直後に動物の頭を取り除きます。脊髄から入ってくるときは、解剖ハサミで両側の後頭顆を切って、脳を傷つけないように注意します。両側を丁寧に切った後、頭頂骨と前頭骨に沿って片側を鼻骨に向かって切ります。鉗子を使用して頭蓋骨の上部を慎重に引き戻し、脳(または目的のCNS構造)をすばやく取り除き、氷上で事前に冷却したDPBS ⁺⁺に入れます。
6. 残りのすべての動物に対して繰り返します.
   手記：進行するすべてのステップは、適切な無菌条件下で層流フードで実行する必要があります。

3. 機械的な解離 (1日目)

1. すべての脳を採取した後、冷たいメスの刃で氷上のシャーレで1つの脳を1 mm³チャンクに切り刻み、5 - 7 mLの氷冷ドウンシングバッファーを備えた氷冷ダウンスホモジナイザーに移します。一度に1つの脳を解離します。
2. 10〜20回の穏やかで不完全なストロークを使用して、ゆったりとしたダウンスホモジナイザーで組織を解離します。ホモジナイザーの底部で組織を直接押しつぶさないように注意し、ピストンとホモジナイザーの側面の間のスペースに組織を押し込みます。
3. 気泡の混入を防ぐため、ピストンを慎重に取り外してください。解離が不十分な組織塊をホモジナイザーの底に沈殿させ、上清を新しい冷却した50mLコニカルチューブに移します。
4. 除去したボリュームを新しいダウンシングバッファーと交換し、手順3.2と3.3を合計3〜4ラウンド、またはすべての組織が解離するまで繰り返します。各脳についてこの手順を繰り返します。

>4. ミエリン除去(1日目)

>注:ミエリン除去は、P12より古い動物からのミクログリアの分離に使用されます。

1. 25 mLピペットを使用して50 mLコニカルチューブ内の細胞懸濁液の容量を測定し、氷冷ドウンシングバッファーを添加して総容量を33.5 mLに調整します。
2. 細胞懸濁液に10 mLのミエリン分離バッファー(MSB)を加え、チューブを数回反転させて十分に混合します。これにより、43.5 mL の容量中に MSB の最終濃度が 23% になります。
3. 細胞を500 x g、4°Cで15分間遠心分離し、ゆっくりとブレーキをかけます.
   手記： 遠心分離機は減速するのに約1.5〜2分かかります。これにより、ミエリンと死細胞の破片の上層、やや濁った上清、および生細胞に濃縮された小さなペレットが生成されます。
4. ミエリン/破片の最上層と上清をピペットで取り除きます。最上層を取り外すときは、できるだけ多くの層が取り除かれるように注意してください。
5. 細胞ペレットを12 mLのパンニングバッファーに再懸濁します。細胞懸濁液を穏やかに粉砕して、残っている可能性のある細胞の塊を分解します。

5. イムノパニング(1日目)

1. 細胞懸濁液を70μmの細胞ストレーナーに通し、大きな破片や細胞塊を取り除きます。
2. OX42でコーティングしたパンニングディッシュをDPBS++で3回すすぎます。洗濯の合間にプレートを完全に乾かさないでください。
3. 最後のDPBS++洗浄液を注ぎ、ろ過した細胞懸濁液をパン皿に塗布します。プレートを静かに渦巻かせて細胞を分散させ、プレートを平らな面に室温で20分間インキュベートして細胞が接着できるようにします。20分以上インキュベートしないと、細胞が皿から回復するのが非常に困難になります。
4. パン皿をDPBS++で10回すすぎ、付着していない細胞を取り除きます。ミクログリアはプレートにしっかりと付着しますので、すすぎのたびにプレートを回転させて、他の非接着性細胞を確実に除去します。
5. 最後のDPBS⁺⁺洗浄液を注ぎ、15 mLのDPBS++と200 μLのトリプシン(1.25%ストック溶液)と交換します。
6. ディッシュを37°Cで≤10分間インキュベートし、10%_CO2でトリプシン化します.
   手記：10分以上続けると、ミクログリアが除去しにくくなります。
7. トリプシン化の10分後、ミクログリアはまだプレートに付着しています。トリプシン/DPBS⁺⁺を注ぎ、DPBS⁺⁺で2回優しく洗浄してトリプシンを取り除き、氷冷したミクログリア増殖培地(MGM)12mLと交換します。
8. パンディッシュを氷の上に2分間置いて細胞と基質の相互作用を弱め、パンディッシュの部分が乾燥しないように皿が平らであることを確認してください。
9. 10mLピペットとピペットコントローラーで高速に激しくピペットを動かし、パンニングディッシュから細胞を回収します。ピペットからの液体の流れで16 x 16のグリッドを描き、すべての細胞を取り除こうとします。
10. 顕微鏡で20倍の倍率で細胞をチェックし、細胞がプレートから剥離したことを確認します。細胞がまだ詰まっている場所を皿の上にマークし、その領域でピペッティングを繰り返します。
11. 細胞懸濁液を採取し、15mLのコニカルチューブあたり3〜4mLの上清を分注します。500 x g、4°C、低速ブレーキで15分間遠心します
    手記： ミクログリアを少量で紡糸することで、細胞の回収率を最大限に高めることができます。
12. 上清を吸引し、0.5 mLのMGMを細胞ペレットに残します。
13. 各ペレットを残りのMGMに再懸濁し、すべてのチューブから細胞をプールします。
14. 血球計算盤で細胞をカウントします。
15. アプリケーションに応じて、ステップ6〜7で説明されているようにセルをプレート化します。
16. 細胞を37°Cで10%_CO2.
    で培養 手記： 細胞は、定期的な培地交換で最大3〜4週間、または培地交換なしで1週間培養できます。

6. スポットコーティング組織培養プレート/カバースリップ (1日目)

1. 24ウェル陰イオン/カチオン性コーティング組織培養プレート(詳細については、材料の表を参照)の中央に直接コラーゲンIVコーティングを15 μLプレートし、10% CO₂で37°Cで15分間インキュベー
トします。
2. 血球計算盤で細胞をカウントした後、MGMで細胞を2.3 x 10⁵ / mLに希釈します。コラーゲンIVスポットを吸引し、すぐにこのスポットに15μLの細胞懸濁液をプレートします。これにより、3.5 x 10³セル/スポットが得られます。細胞が接着できるように、10% CO₂を用いて37°Cで5〜10分間インキュベートし、500 μLのCO₂-平衡化TGF-β2/IL-34/コレステロール含有増殖培地(TIC)をウェルに穏やかに加えます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ダウンシングバッファ			レシピ:200 μL の 0.4% DNaseI を 50 mL の DPBS++ に溶かして コメント:氷のように冷たいときに使用してください
パン バッファ			レシピ:DPBS++中の乳固形分から2mg/mLのペプトン
ミクログリア増殖培地(MGM)			レシピ:100 units/mL ペニシリン、100 μg/mL ストレプトマイシン、2 mM グルタミン、5 μg/mL N-アセチルシステイン、5 μg/mL インスリン、100 μg/mL アポトランスフェリン、100 ng/mL セレン酸ナトリウム を含む DMEM/F12 コメント:氷冷MGMを使用して、イmmnopanning皿からミクログリアをパンオフします。
コラーゲンIVコーティング			レシピ:2 μg/mL コラーゲン IV を含む MGM
ミエリン分離バッファー			レシピ:Percoll PLUS 9 mL、Ca++ および Mg++ を含まない 10x PBS 1 mL、1 M CaCl2 9 μL 1 M CaCl2、1 M MgCl2 コメント:CaCl2とMgCl2を添加した後、よく混合
トリプシン	シグマ	T9935
DMEM/F12	ギブコ	21041-02
ペニシリン/ストレプトマイシン	ギブコ	15140-122
DMEM(高グルコース)	ギブコ	11960-044
コラーゲンIV			再構成:PBS で200μg/mL 使用濃度:1:100 保管:-80°C
マウス抗ラットCD11bモノクローナル(クローンOX42)	バイオ・ラッド	MCA275R	パンニング:1:1,000;染色:1:500
TGF-b2/IL-34/コレステロール含有増殖培地(TIC)			レシピ:ヒト 2 ng/mL TGF-b2、100 ng/mL マウス IL-34、1.5 μg/mL ヒツジウールコレステロール、10 μg/mL ヘパラン硫酸、0.1 μg/ml オレイン酸、0.001 μg/mL ゴンドイン酸 を含む MGM コメント:37°Cに温めた培地には必ずコレステロールを添加し、1.5μg/mL以上は添加しないでください。コレステロール含有媒体をろ過しないでください。TIC培地を10%CO2で30分間1時間平衡化してから、細胞に添加して最適なpHを確保します。
パーコールプラス	GEヘルスケア	カタログ番号# 17-5445-02
プリマリアプレート	VWRの	カタログ番号# 62406-456
DNaseIの	ワージントン	Cat# DPRFS (英語)

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