方法論記事

NMDGベースの保護回復法を用いた脳切片の調製

2025年7月8日

この記事について

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

出典:Ting, J. T. et al. 最適化されたN-メチル-D-グルカミン保護回復法を使用した急性脳スライスの調製。 J. Vis. Exp. (2018年)。

このビデオでは、N-メチル-D-グルカミン(NMDG)ベースの保護回復法を使用して脳スライスを取得するプロトコルについて説明しています。解剖した脳は、NMDGおよびHEPESを含むaCSFでインキュベートされ、切片化中のニューロン細胞の死と損傷を最小限に抑えます。このセクションは、細胞活動を回復するためにaCSFで回復することが許可されています

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 脳の解剖とスライス

  1. 動物の首を切ります。メスを使って頭の上の皮膚を開き、頭蓋骨を露出させます。
  2. 細かいスーパーカットハサミを使用して、頭蓋骨キャップの上の皮膚を切り取り、頭蓋骨の尾側/腹側の基部で両側に小さな切開を行います。頭蓋骨の尾側/背側から始めて、下にある脳に損傷を与えないように注意しながら、背側正中線を吻側方向に移動して、追加の浅い切り込みを入れます。嗅球のレベルで正中線に垂直に最終的な「T」カットを作成します.
    手記：関心のある脳領域に損傷を与えないように注意を払う必要があります。特に、脳自体に圧縮力が加えられるべきではありません。
  3. 丸い先端の鉗子を使用して頭蓋骨をつかみ、吻側内側の側面から始まり、尾側方向に向かって剥がします。両側に亀裂が入り、頭蓋骨の背側半分を取り外して脳を露出させるように繰り返します。無傷の脳を、あらかじめ冷やしたNMDG-HEPES aCSFのビーカーにそっとすくい取ります。脳が~1分間均一に冷えるのを待ちます。
  4. 大きなヘラを使って、脳をビーカーから持ち上げ、濾紙で覆われたペトリ皿に乗せます。スライスの好ましい角度と関心のある脳の望ましい領域に従って、脳をトリミングおよびブロックします。取り扱い中の酸素欠乏が長引かないように迅速に作業してください.
    手記：多くのスライス角度が可能です。正確なブロッキング方法とスライス角度は、研究する正確な脳領域、細胞の種類、および回路によって異なります。
  5. ブレインブロックを接着剤で試料ホルダーに貼り付けます。検体ホルダーの内側部分を十分に引っ込めて、脳ブロックを完全に内側に引き込みます。脳ブロックがアガロースで完全に覆われるまで、溶融したアガロースをホルダーに直接注ぎます。アガロースが固まるまで、予冷したアクセサリー冷却ブロックを試料ホルダーの周りに~10秒間クランプします。
  6. 試料ホルダーをスライサーマシンのレセプタクルに挿入し、適切な位置合わせを確認します。250 mLビーカーから事前に冷却された酸素化されたNMDG-HEPES aCSFをリザーバーに充填し、スライス中にバブルストーンをリザーバーに移動して、適切な酸素化を確保します。
  7. マイクロメーターを調整して、アガロースに埋め込まれた脳標本の前進を開始します。スライサーを始動し、前進速度と振動周波数を希望のレベルに経験的に調整します.
    手記：どちらの設定も低範囲にする必要があります。最良の結果を得るには、ブレードアームの1回のパスに約20秒かかり、振動によって非常に滑らかで穏やかなブーンという音が発生し、あからさまなブーンという音が鳴りません。
  8. 関心のある脳領域が完全に切片化されるまで、組織を300μm刻み(または他の好ましい厚さ)で前進させ、スライスし続ける;スライス手順の合計時間は15分未満であるべきである。

2. 最適化されたNMDG保護回復手順

  1. NMDGの初期回収ステップ(クリティカルステップ):切片作成手順が完了したら、切断されたプラスチック製パスツールピペットを使用してすべてのスライスを回収し、150 mLのNMDG-HEPES aCSFで満たされた予熱済み(34°C)の初期回収チャンバーに移します。すべてのスライスを短時間連続で転送し、すべてのスライスがリカバリーチャンバーに移動するとすぐにタイマーを開始します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
利益相反は宣言されていません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
コンプレッテーム VF-200精密機器VF-200振動ティッシュスライサー(推奨)
N-メチル-D-グルカミンシグマ・アルドリッチM2004aCSF成分
塩化ナトリウムシグマ・アルドリッチS3014aCSF成分
塩化カリウムシグマ・アルドリッチP5405aCSF成分
リン酸ナトリウム一塩基性二水和物シグマ・アルドリッチ71505aCSF成分
炭酸水素ナトリウムシグマ・アルドリッチS5761aCSF成分
ヘープスシグマ・アルドリッチH4034-JaCSF成分
グルコースシグマ・アルドリッチG7021aCSF成分
アスコルビン酸ナトリウムシグマ・アルドリッチA4034のaCSF成分
チオ尿素シグマ・アルドリッチT8656aCSF成分
ピルビン酸ナトリウムシグマ・アルドリッチP5280aCSF成分
塩化カルシウム二水和物シグマ・アルドリッチC7902aCSF成分
硫酸マグネシウム七水和物シグマ・アルドリッチM1880aCSF成分
湾曲した鈍い鉗子ファインサイエンスツール11065から07脳解剖ツール
細解剖ハサミ(スーパーカット)ファインサイエンスツール14058から09脳解剖ツール
大型ヘビーデューティーハサミ7インチファインサイエンスツール14000-18脳解剖ツール
金属ヘラシグマ・アルドリッチZ511455-1パック脳解剖ツール
カミソリの刃VWRの89031-954脳解剖ツール
脳スライスキーパー-4科学的な自動化S-BSK4ブレインスライス保持室
ナイロンネットワーナー・インストゥルメンツ〒64-0198小さなスライス回収チャンバーの構築に
パイレックスガラスビーカー(250mL)VWRの89090から434小さなスライス回収チャンバーの構築に
35 mm プラスチック皿 丸型VWRの100488-376小さなスライス回収チャンバーの構築に
ガス拡散石(10μm)シグマ・アルドリッチ59277一定のカルボギン化(微細な気泡)に
アガロース I-B タイプシグマ・アルドリッチA0576脳試料の埋め込みに
塩酸シグマ・アルドリッチH1758-100ミリリットルメディアのpH調整用
水酸化ナトリウムシグマ・アルドリッチ221465から25GメディアのpH調整用
水酸化カリウムシグマ・アルドリッチ221473メディアのpH調整用
プラスチック製トランスファーピペット 3 mL 目盛り付きVWRの89497から676スライス転送用
ジルコニウムセラミックインジェクターブレードケイデンス特殊ブレードEF-INZ10http://cadenceinc.com/
温水浴(2.5L)VWRの13491-060雑
ろ紙ラウンドVWRの28456から022雑
シアノアクリレート接着剤アマゾンB000BQRBO6雑
ガラスシャーレVWRの89000-326雑
10X リン酸緩衝生理食塩水シグマ・アルドリッチP5493雑
サーモミキサー(1.5mLチューブブロック付き)VWRの89232-908アガロースを溶かしておくために
の 型 型 の 型 型 さん 型

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

NMDG HEPES aCSFBrain SectioningAcute Brain SlicesProtective Recovery MethodArtificial Cerebrospinal FluidAgarose EmbeddingVibratome SlicingSlice Recovery ChamberNeuronal Cell ViabilityElectrophysiological Properties

関連記事