網膜の神経組織の長期インキュベーション技術

要約

出典:Cameron, M. A., et al. Extending Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging. J. Vis. Exp. (2017).

このビデオは、網膜のニューロン組織を長期間インキュベーションする方法を示しています。網膜を含むアイカップは、マウスの眼から得られます。内側の限界膜(ILM)は酵素的に消化されて網膜の神経細胞を露出させ、処理されたアイカップまたは分離された網膜のいずれかを専用のインキュベーターに移して、低温で長時間インキュベーションします。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. レチナールホールマウントの調製とインナーリミッティングメンブレンの除去

1. 通常の実験室の照明条件または薄暗い赤色/赤外線のいずれかで網膜ホールマウントを準備します。
2. 頸部脱臼によって動物を安楽死させ、すぐに眼球を摘出します。ora serrataに沿って小さな切り込みを入れ、Ames培地または(mM)を含む人工脳脊髄液(aCSF)のいずれかに入れます:125 NaCl、25 NaHCO₃、3 KCl、2 CaCl₂、1 MgCl₂、10グルコース、0.5 L-グルタミン、およびカルボゲン(95% O₂/5% CO₂混合物; ~300 mOsm; pH 7.4)で飽和させます(RT)。
3. 小さなハサミでオラセラータに沿って切り、レンズと硝子体を鉗子で取り除いて、角膜、水晶体、硝子体をすぐに取り除きます。組織をインキュベーションシステムのRT.
   に置きます 手記： 網膜組織は、必要なまでインキュベーションシステム内で>24時間、15〜16°Cにゆっくりと温度を下げた後、アイカップ内に保持できます。
4. ILMを除去するには、網膜を含むアイカップを、30 U / mLパパイン、1 mM L-シスチン、0.5 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、および0.005%デオキシリボヌクレアーゼ(DNase)が入った小さなガラス瓶に移します。Earl's Balanced Salt Solution(BSS)で37°Cで20分間、95% O₂/5% CO₂を蓋を通して溶液に適用しますが、泡立たないでください。若い動物からの組織を使用する場合(<6週間)、溶液を半分の強度に希釈します。.
   1. 組織をオボムコイド(10 mg / mL)およびウシ血清アルブミン(BSA、10 mg / mL)溶液に10分間Earl's BSSで10分間入れて、酵素消化を停止します。.インキュベーションシステムに移す前に、組織をaCSFで十分に洗浄し、温度を15〜16°Cに下げます。
5. 必要になるまでアイカップ内の網膜組織を維持します。.顕微鏡に移すには、アイカップから網膜を分離し、かみそりの刃で4つに切ります。網膜全体が必要な場合は、網膜の周囲に4つの小さな切り込みを入れて、網膜を平らにできるようにします。
   手記： イメージング実験では、インキュベーションシステムに移す前にカルシウム色素をロードしてください(以下を参照)。

2. インキュベーター内の組織の維持

1. pHおよび温度測定用のプローブを含むメインチャンバーに組織を置きます(図1A、B)。
2. メインチャンバーから分離し、1.1 W紫外線C(UVC)光(254 nm、5W / 2P滅菌器UVランプ)に曝露した第2チャンバー(UVCチャンバー、前述のように構築)を介してaCSFを循環させ、溶液中に浮遊する細菌を根絶します(図1A)。aCSFの過度の加熱を避けるために、15〜30分ごとに15〜26分の間で変化する時間にオンになるランダム機能を使用して、プログラム可能なタイマーを介してUVCライトのタイミングを制御します。
3. 以前に報告したように、UVCチャンバー内の流量を12 mL / minに設定します。UVCチャンバーをアルミホイルで覆い、ニューロン組織に損傷を与える可能性のあるチャンバー外のUVC照明を防ぎます
   手記： 暗順応した網膜組織の場合は、光を遮断するためにメインチャンバーにカスタムメイドのカバーを適用します。
4. 蠕動ポンプを使用して溶液(aCSF)を2つのチャンバーに循環させ、ペルチェ熱電コールドプレートクーラーを使用してメインチャンバーを0〜50°Cの範囲で所望の温度に冷却または加熱します。最適な組織インキュベーションのためには、15 - 16 °Cを使用して長期的な生存率を確保します。

結果

図 1.組織環境を厳密に制御するインキュベーションシステムです。A、冷却ペルチェプレート、メインチャンバー、ペリスタルティックポンプ、UVCチャンバーで構成されるインキュベーションシステムの概略図。B、aCSFの入口と出口のポイント、およびカルボゲンの入口、温度、pHプローブを示すメインチャンバーの側面図。示されているように、組織をメッシュ上に配置します。すべての測定プローブは蓋に取り付けられており、構造的な安定性を確保しています。C、インキュベーション中のaCSFの温度とpHを説明するaCSFパラメータスタンプ。D、測定プローブの取り付け穴を示すメインチャンバーの上面図。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
塩化ナトリウム	シグマ アルドリッチ VETEC	V800372
塩化カリウム	シグマ・アルドリッチ	P9333型
N-メチル-D-グルカミン	シグマ・アルドリッチ	M2004
D-グルコース	シグマ・アルドリッチ	G5767
炭酸水素ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	S6014
塩化マグネシウム	シグマ・アルドリッチ	M9272
塩化カルシウム	シグマ・アルドリッチ	223506
パパイン解離システム	ワージントン	LK003150
固定ステージ正立顕微鏡	オリンポス	BX51WI
顕微鏡対物レンズ	オリンポス	XLUMPlanFLN 20倍/1.00ワット	20倍
顕微鏡対物レンズ	オリンポス	LUMPlanFLN 60x/1.00w	60倍
ブラインキュベーター	パヨサイエンティフィック	BR26021976	www.braincubator.com.au
ペルチェ熱電式コールドプレートクーラー	TE の技術	CP-121
温度コントローラー	TE の技術	TC-36-25 RS232