マウスの脳梁下ゾーンからの成体神経幹細胞の単離と培養

要約

出典:Kim, J. Y., et al.マウスの脳梁下ゾーンからの成体神経幹細胞の単離と培養。J. Vis. Exp.(2016年)

このビデオは、マウスの脳のサブカロサルゾーンから神経幹細胞を分離して培養するプロセスを示しています。これには、組織を解剖し、酵素で解離し、分化因子で培養して成熟した神経細胞に成長させることが含まれます。

プロトコル

1. 材料と培地の準備

1. SCZ(脳梁下領域)の解剖と解離には、脳マトリックス、両刃のカミソリ刃、鉗子をアルミホイルで包み、オートクレーブ滅菌します。
2. マウスの脳全体を洗浄するために、50mlの冷たいPBS(リン酸緩衝生理食塩水)緩衝液を調製します。
3. 解剖顕微鏡を設置し、脳の解剖(オートクレーブハサミと鉗子)とSCZの分離(1mlシリンジ、30G針、脳マトリックス、細い鉗子)に必要な手術器具を準備します。
4. N2培地の調製:
   1. F-12/DMEM(+L-グルタミン、+重曹)培地に2%B27、1%N2サプリメント、1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加します
      注:増殖培地は、N2培地と成長因子(20 ng/mL精製上皮成長因子(EGF)および20 ng/mL塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF2))で構成されています。
5. 組織消化用の消化バッファー(40ユニット/ mlパパイン、2.4ユニット/ mlディスパーゼII、およびPBS中の2%ペニシリン-ストレプトマイシン)を調製します。.
6. コーティングプレートとカバースリップの準備:
   1. ポリ-L-オルニチン(PLO;0.01%)とラミニン(DH₂Oに溶解した10 μg/mL)を調製します。SCZ-aNSC(成体神経幹細胞)のメンテナンス用に6ウェルプレートをコーティングするか、免疫染色用の18 mmカバースリップをコーティングするには、PLOと4°Cで一晩インキュベートします。次に、DH₂Oで3回洗い、最後の洗浄後にプレートとカバースリップを乾かします。
   2. 次に、プレートをラミニンと4°Cで一晩インキュベートします。次に、DH₂O.
      で3回洗います 注意:細胞の付着に影響を与えるラミニンを乾燥させないでください.
      注:コーティング液は3回再利用できます。

2. 成体SCZの孤立と解離

1. 培養調製の前に、ブレインマトリックスと両刃のカミソリを氷の上に置きます.
   注:脳マトリックスは、脳が付着する可能性があるため、凍結しないでください。
2. マウス(生後8週間)を_CO2窒息または子宮頸部脱臼により犠牲にします。
   1. 70%エタノールをスプレーした後、鋭利なハサミで頭を切り落とします。頭を固定するには、頭の両側をしっかりと保持します。正中線で尾側 - 吻側方向にハサミで皮膚を切ります。これにより、頭蓋骨からの皮膚の完全な除去が促進されます。
   2. 最初に頭蓋骨の尾側部分(ラムダの後部)を取り外し、次に鉗子を頭蓋骨と脳の間に背側正中線位置に挿入します。左(または右)の頭頂骨をつかみ、慎重に剥がします。この手順を繰り返して、もう一方の頭頂骨を切除します.
      注:視神経の切断と脳からの髄膜の除去により、脳を頭蓋骨から切り離しやすくなります。
   3. 脳を冷たいPBSバッファー(25 ml)に移し、2回すすいで余分な血液を取り除きます。
3. 氷上の脳マトリックスに脳を入れ、冠状にカットして厚さ1mmのスライスにします。脳の後部に位置するSCZ領域を含む脳スライス(1 mm)を、35 mmのプラスチックシャーレ内の冷たいPBSに移します><。 注意：冠状切片の平行面を得るためには、脳裂傷が脳マトリックスの正中線に配置されていることを確認してください。セクションの不必要なバリエーションを避けることが重要です。
   手記：ブレグマの後方2〜3mmで脳スライスを取得します。これにより、SCZをSVZ(脳室内ゾーン)から分離することができます。
4. 低倍率の解剖顕微鏡下で、曲げた30G針6,9で皮質および海馬の白質領域からSCZをマイクロ解剖する。次に、SCZの上の皮質領域を削除します。スライスから解剖したSCZ領域を、冷たくないPBSを氷の上の35mmプラスチックシャーレに置きます.
   手記：成熟ニューロンを含む余分な領域の汚染は、aNSC培養条件で細胞死を受けるため、aNSCの生存率とニューロスフェア形成に影響を与える可能性があります。
5. 曲げた30Gの針を使用して、解剖した組織をすぐに細かく刻みます
   手記：SCZ組織の解剖に長い時間が必要な場合は、解剖した組織を冷たいPBSに浸してからチョッピングしてください。
6. 刻んだ組織を1 mLの消化緩衝液で再懸濁し、2 mLの消化緩衝液が入った15 mLチューブに組織を移し、37°Cの水浴で30分間インキュベートします< br /> 手記：チューブを10分ごとに振ってよく混ぜます。

3. 脳梁下帯由来成体神経幹細胞培養

1. チューブを軽くたたいて消化組織を解離し、チューブを145 x gで5分間遠心分離します。上清を捨て、消化組織を1 mLの予熱したN2培地で再懸濁して消化バッファーを洗い流し、P1000ピペットを使用してサンプル溶液を最大5回静かにピペットします
   手記： 細いピペットチップで過剰に粉砕すると、細胞の生存率とその後の増殖が低下する可能性があります。
2. チューブを145 x gで5分間遠心分離します。上清を捨てた後、細胞ペレットをN2培地1 mLに再懸濁します。
3. コーティングされていない6ウェルプレートに1 mLのN2培地を調製し、懸濁細胞1 mLを加えて最終容量を2 mLにします。
4. EGF(20 ng/ml)とbFGF(20 ng/ml)を各ウェルに加えます。6ウェル培養皿を手で静かに振って、添加した成長因子を播種した細胞と混合します。6ウェルプレートを37°C、5%_CO2インキュベーターに保管します。
5. EGF(20 ng/ml)とbFGF(20 ng/ml)を各ウェルに8日間毎日加えます。3日おきに200μlのN2培地を添加し、培地の容量を約2 mLに保ちます。

4. 神経細胞のニューロスフェアおよび単層培養への継

代

1. ニューロスフィアを集めて、新しい15mlのコニカルチューブに移します。
   注:1匹のマウス脳のSCZからのウェルあたりのニューロスフェア数(直径>50μm)は64.3±7.31であり、SVZの数(190.5±6.33)よりも少なかった。
2. ニューロスフェアを0.5 mLの解離バッファーと共に37°Cのウォーターバスで5分間インキュベートし、ニューロスフェアを単一細胞に解離します。初代ニューロスフェアは、単一細胞に解離し、ニューロスフェアまたは単層培養としていくつかの継代にわたって維持することができます。
   手記：SCZ-aNSCは単層培養形式では>10回、ニューロスフィア培養形式では<5回継代できるため、SCZ-aNSCを単層として拡大することはニューロスフェアよりも優れています。
   注意：SCZ-aNSCは強い凝集を示し、それらを単一細胞に解離させることは困難です。したがって、ニューロスフィア培養フォーマットは、日常的な細胞増殖には推奨されません。
3. P1000ピペットでサンプル溶液を5回未満で静かに上下にピペットで動かし、チューブを145 x gで5分間遠心分離します。上清を廃棄し、ニューロスフェアを1 mlのN2培地で再懸濁します
   手記：細いピペットチップで過剰に投与すると、細胞の生存率とその後の増殖が低下する可能性があります。
4. 細胞をカウントするには、細胞懸濁液(10μl)と0.4%トリパンブルー溶液を1:1で混合し、血球計算盤で生細胞の数をカウントします。6ウェルプレートをPLO/ラミニンでコーティングした後、各ウェルに2 mLのN2培地を2.5 x 105 cells/mlでプレートします
   手記：細胞密度の変化は、細胞の状態や分化能に影響を与える可能性があります。
5. 成長因子の毎日の治療(2 ml、20 ng / ml)でSCZ-aNSCを5日間維持し、その後継代します。

5. 脳梁下帯由来成体神経幹細胞の分化

1. PLO/ラミニンコーティングされた18 mmカバースリップに、成長因子(20 ng/ml)を含むN2 1 mL 1 x 105 cells/mlを充填し、SCZ-aNSCを分化させます。
2. 翌日、細胞がカバーガラスにしっかりと付着したら、増殖培地をN2と交換して成長因子を除去します。
3. 6日後、分化した細胞を1mlのPBSで洗浄して細胞破片を取り除き、免疫染色のために固定します
   注:BrdUは、増殖細胞の新しく合成されたDNAに組み込むことができます。したがって、必要に応じて、細胞を固定する前にBrdU(10 μg/ml)を生細胞に添加することができます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM/F12	ギブコ	〒11320-033	L-グルタミン、重炭酸ナトリウム
ペン/連鎖球菌	インビトゲン	15140-122
N2サプリメント	ギブコ	17502-048
B27サプリメント	ギブコ	17504-044
bFGFの	研究開発	233-FB
EGFの	ギブコ	PHG0313
PBSの(10X)	バイオソリューション	BP007a	1倍希釈
HBSSの	ギブコ	14175-095
ディスパーゼII	ロシュ	04-942-078-001
パパイン	ワージントン	3126
アキュターゼ	情報通信技術	AT-104
細い鉗子	WPIの	555229ファックス
鋏	ストルツ	E3321-C
脳マトリックス(1mm)	RWDの	68707
両刃のカミソリ	ドルコ	ST-300
30ゲージの針	ソンシム	N1300
15mlチューブ	SPLの	50015
50mlチューブ	SPLの	50050
35mmディッシュ	SPLの	10035	ペトリディッシュ
100mmディッシュ	SPLの	10090	ペトリディッシュ
カバースリップ(18mm)	デックレーザー	111580
12ウェルディッシュ	SPLの	32012	ノンコーティング
6 ウェルディッシュ	SPLの	32006	ノンコーティング
PLOの	シグマ	P4957	0.01パーセント
ラミニン	ギブコ	23017-015	10 mg / ml
ネスティン	ミリポア	マブ353	マウス(1:1000)
ブルドゥ	アブカム	AB第6326	ネズミ(1:500)
ペニシリン
ストレプトマイシン
解剖顕微鏡
遠心機
P1000ピペット
ウォーターバス
CO2インキュベーター
トリパンブルー
血球計算盤

の (代表) 名 年 年 型 の 号