介在ニューロンと脳室内皮細胞との共培養の確立

要約

出典:Datta, D., et al. ヒト幹細胞由来内皮細胞およびGABA作動性ニューロンの移動、化学吸引、および共培養アッセイ。J. Vis. Exp.(2020年)

このビデオは、介在ニューロンと血管周囲内皮細胞との共培養を確立する技術を示しています。細胞を培養皿の中に置いたワンウェルインサートに加えます。細胞がディッシュに付着した後、インサートが取り除かれ、細胞が増殖して相互作用し、共培養が形成されます。

プロトコル

1. ヒト脳室周囲内皮細胞の培養と保存

1. 脳室周囲内皮細胞培地(50 ng/mL血管内皮増殖因子A[VEGF-A]、100 ng/mL線維芽細胞増殖因子2[FGF2]、5μMガンマアミノ酪酸[GABA]を含むE6培地)の基底膜マトリックスコーティング(材料表参照)6ウェルプレート上のヒト脳室周囲内皮細胞を、37°Cおよび5%_CO2で維持します。隔日で媒体を交換してください。
2. 基底膜マトリックスを4°Cで解凍し、冷たいダルベッコの改質イーグル培地/栄養混合物F-12(DMEM / F12)培地で希釈して1:100の溶液を作ります。6ウェルプレートの各ウェルに1 mLのマトリックス溶液をコーティングします。プレートを37°Cで少なくとも1時間インキュベートしてから使用してください。
3. ヒトの脳室周囲内皮細胞が80%〜90%のコンフルエントに達するのを待ちます。井戸から培地を吸引します。ウェルごとに1 mLの滅菌1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)でウェルを1回洗浄します。
4. ウェルあたり1 mLの細胞解離溶液(材料表を参照)を添加して細胞を剥離します。37°Cで5分間インキュベートします。5分後、1 mLの脳室周囲内皮細胞培地を追加します。.細胞溶液を15mLのコニカルチューブに移します.
   手記：ここでは、細胞の解離にAccutaseを使用しますが、セクション3と4ではTrypLEを使用します。
5. 細胞を500 x gで室温で5分間遠心分離し、上清を吸引し、細胞ペレットを1 mLの脳室周囲内皮細胞培地に再懸濁します。
6. トリパンブルー排除法を使用して生細胞をカウントします。新鮮なマトリックスコーティングプレート中の細胞を1.2 x 10⁵細胞/cm²の密度で播種します。37°Cおよび5%CO₂でインキュベートします。
7. 凍結培地(90%脳室内皮細胞培地および10%ジメチルスルホキシド[DMSO])で凍結保存することにより、ヒト脳室周囲内皮細胞を保存します。
   1. 上記の手順1.3および1.4に従って細胞を解離および収集します。溶液中の細胞をトリパンブルー排除法でカウントします。
   2. 細胞を500 x gで室温で5分間遠心分離します。上清を吸引し、細胞ペレットを5 x 10⁶細胞/ mLの凍結培地に再懸濁します。
   3. クライオバイアルあたり1 mLの凍結培地と細胞を分注します。バイアルをイソプロパノール充填チャンバーに入れ、-80°C、1°C/分で一晩冷却します。バイアルを翌日液体窒素タンクに移し、長期保存します。

>2. ヒト脳室周囲内皮細胞のアッセイ用調製

1. ヒトの脳室周囲内皮細胞が70%〜80%のコンフルエントに達するまで待ちます。
2. 上記のように、ステップ1.3〜1.5に従ってセルを解離します。トリパンブルー排除法を使用して細胞をカウントします。

3. アッセイのためのヒトGABA作動性介在ニューロンの調製

>注:ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)由来のGABA作動性介在ニューロンとニューロン培地は商業的に購入されました(資料の表を参照)。ニューロンは、メーカーが開発したプロトコルに従って、ヒト線維芽細胞由来iPS細胞株を分化することによって生成されます。細胞を解凍し、メーカーのプロトコルに従って培養しました。

1. ヒトGABA作動性介在ニューロンを解凍し、12ウェルプレートで2週間培養して、70%〜80%のコンフルエントにします。
2. アッセイ当日は、温細胞解離溶液(材料表を参照)と神経細胞培地のアリコートを37°Cで10分間使用前にしてください。
3. 細胞を含む各ウェルから培地を吸引します。ウェルあたり1 mLの滅菌済み1x PBSで細胞を洗浄します。
4. ウェルあたり0.5 mLの予熱解離溶液を加えて細胞を分離し、37°Cで5分間インキュベートします。細胞溶液を15 mLのコニカルチューブに移します。細胞の凝集体を解離するために穏やかに粉砕します。
5. 細胞を380 x gで室温で5分間遠心分離し、上清を吸引し、細胞ペレットを1 mLの神経培地に再懸濁します。トリパンブルー排除法を使用して生細胞をカウントします。

4. アッセイ用コントロールヒト内皮細胞の調製

>注:対照ヒトiPS細胞由来の内皮細胞と内皮細胞培地は市販されました（資料表〉。これらの内皮細胞は、メーカーが開発したプロトコールに従って、ヒト線維芽細胞由来iPS細胞株を内皮運命に分化させることによって生成されます。細胞を解凍し、製造元のプロトコルに従ってフィブロネクチン基質上で培養しました。フィブロネクチンコーティングプレートは、メーカーのプロトコルに従って調製しました。

1. 解凍はヒト内皮細胞を制御し、6ウェルプレートで80%〜90%のコンフルエント度で培養します。
2. アッセイ当日は、温細胞解離溶液(材料表を参照)と内皮培地のアリコートを37°Cで10分間使用前にしてください。
3. 細胞を含む各ウェルから培地を吸引します。ウェルあたり1 mLの滅菌済み1x PBSで細胞を洗浄します。
4. ウェルあたり0.5 mLの予熱解離溶液を加えて細胞を剥離します。室温で5分間インキュベートします。ウェルあたり1 mLの内皮細胞培地を添加して、解離溶液を中和します。細胞溶液を15 mLのコニカルチューブに移します。
5. 細胞を200 x gで室温で5分間遠心分離します。上清を吸引し、細胞ペレットを1 mLの内皮細胞培地に再懸濁します。トリパンブルー排除法を使用して生細胞をカウントします。

5. ワンウェル培養インサートの調製

1. 1 mg/mL ラミニン溶液を室温で、または 4 °C で一晩解凍します。
2. 35 mm皿に0.01%ポリ-L-オルニチン溶液(1皿あたり1 mL)を適数塗布します。皿を室温で少なくとも1時間インキュベートします。
3. 使用直前に、1 mg/mL ラミニン溶液 1:300 を滅菌水で希釈し、最終濃度 3.3 μg/mL にします。
4. 各皿からポリ-L-オルニチンを完全に吸引します。滅菌水で各皿を3回十分にすすぎ、ポリ-L-オルニチンによる細胞毒性を避けるために完全に吸引します。
5. 各ディッシュに3.3 μg/mLラミニン溶液1 mLを加え、37°Cで一晩または少なくとも1時間インキュベートします。使用直前にディッシュからラミニン溶液を取り除きます
   手記：あるいは、ラミニン含有ディッシュを4°Cで保存し、使用前に37°Cの細胞培養インキュベーターでディッシュを平衡化します。
6. 滅菌ブレードを使用して、2ウェルシリコーン培養インサート(図1A)の1ウェルの3辺を切断し、1ウェルインサート(図1B)を生成します
   手記： カット中は、2ウェルインサートを元のパッケージの表面にしっかりと取り付けたままにしておくと、スムーズなカットを確保し、インサートの接着性を保護します。
7. 皿からのラミニン溶液を吸引します.
   手記： ラミニンインキュベーション後は、滅菌PBSまたは水で皿を洗わないでください。表面が濡れていると、培養インサートの密着が妨げられます。
8. 滅菌ピンセットでワンウェルインサートを取り外し、ポリ-L-オルニチン/ラミニンコーティングディッシュの中央に置きます。インサートの端に沿って押して、皿の表面に固定します。
9. 皿を慎重に逆さまにして、インサートがしっかりと接着されていることを確認します。
10. 皿を逆さまに保ち、先端が極細の油性黒マーカーを使用してインサートコンパートメントの境界に印を付けます(図1C)。

6. 共培養移行アッセイ

1. 3 x 10⁴ GABA作動性介在ニューロンと3 x 10⁴ヒト脳室周囲内皮細胞を70 μLの共培養培地(50%はGABAなし、50%はニューロン培地)に共懸濁します。この細胞溶液を1ウェルインサートコンパートメント内に播種します。このようなアッセイディッシュを適切な数調製してください.
   手記： GABAは、外因性GABAの遊走への影響を排除するために、共培養培地に添加されませんでした。
2. 顕微鏡でチェックして、細胞がインサートコンパートメントから漏れていないことを確認します。
3. コーティングが乾燥するのを防ぐために、皿の側面に沿って1mLの共培養培地をゆっくりと加えます.
   手記：インサートが邪魔されないように、皿の端に沿ってゆっくりと中肉を加えます。
4. 最初のコントロールとして、3 x 10⁴ ヒト GABA作動性介在ニューロンを、1ウェルインサートあたり 70 μL の共培養培地にのみ播種します。そのような料理を適切な数用意してください。
5. 第2のコントロールとして、3 x 10⁴ GABA作動性ヒト介在ニューロンを3 x 10⁴コントロールヒト内皮細胞に1ウェルインサートあたり70 μLの共培養培地で共播種します。適度な数の料理を用意してください。
6. 皿を37°Cおよび5%CO₂で24時間インキュベートします。24時間のインキュベーション後、顕微鏡で細胞が適切に付着し、漏れがないことを確認します。
7. 播種の48時間後、滅菌ピンセットを使用してインサートを静かに取り出します。顕微鏡で細胞層が乱されていないことを確認します(0日目)。
8. 培地を取り出し、新鮮な共培養培地1mLを加えます
   手記： 0 日目の画像を取得するために、適切な数の皿を確保します。
9. 細胞を37°Cおよび5%CO₂で5日間インキュベートします。

結果

図1:培養インサートの準備。(A)2ウェル培養インサート。(B)35mmディッシュの中央に固定されたワンウェルインサート。(C)インサートを取り外した後に観察された長方形のパッチの輪郭。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アキュターゼ解離溶液	ミリポアシグマ	SCR005	細胞解離液(脳室周囲内皮細胞用、ステップ1.4)
ヒト内皮細胞の制御	細胞ダイナミクス	R1022
コントロール内皮細胞培地サプリメント	細胞ダイナミクス	M1019
極低温バイアル	フィッシャーサイエンティフィック	03-337-7Y
DMEMF/12 ミディアム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11320033
DMSOの	シグマ・アルドリッチ	D2650
E6 ミディアム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A1516401
FGF2	サーモフィッシャーサイエンティフィック	PHG0261
フィブロネクチン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	33016-015
冷凍コンテナ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	5100
ギャバ	シグマ・アルドリッチ	A2129の
血球計算盤	シグマ・アルドリッチ	Z359629
ヒトGABA作動性ニューロン	細胞ダイナミクス	R1013
ヒトGABA作動性ニューロンベース培地	細胞ダイナミクス	M1010
ヒトGABA作動性ニューロン神経サプリメント	細胞ダイナミクス	M1032
ラミニン	シグマ	L2020
マトリゲル	コーニング	356230	基底膜マトリックス
封入媒体	ベクターラボ	H-1200
ポリ-L-オルニチン	シグマ	P4957
PBSの	サーモフィッシャーサイエンティフィック	14190
トリパンブルー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15250061
トリプル	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12563011	細胞解離液(GABA作動性介在ニューロンおよび内皮細胞用、セクション3および4)
ベグフ-A	ペプロテック	100-20
VascuLife VEGF ミディアムコンプリートキット	ライフラインセル技術	LL-0003	コントロールヒト内皮細胞培地の成分
2ウェルシリコーン培養インサート	同上	80209
3ウェルシリコーン培養インサート	同上	80369
35mmディッシュ	コーニング	430165
15mlコニカルチューブ	フィッシャーサイエンティフィック	07-200-886
4% PFA溶液	フィッシャーサイエンティフィック	AAJ19943K2
6ウェル組織培養プレート	フィッシャーサイエンティフィック	14-832-11

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