器官型スライス共培養モデルにおける脳腫瘍の確立

要約

出典:Chadwick, E. J. et al. 腫瘍微小環境および標的薬物療法を研究するための脳腫瘍/器官型スライス共培養システム。 J. Vis. Exp.(2015年)。

このビデオは、3D共培養システムの開発を示しています。マウスの脳切片を膜上に置き、蛍光標識したヒト脳腫瘍細胞をその上で増殖させます。システムの準備ができたら、イメージングのために染色します。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. インサートへのスライスのメッキ

1. 6ウェルプレートの各ウェルに1,200 μlのスライス培養培地を充填します。未使用のウェルには1,200 μl PBSを充填し、プレートの中央スペースに1x PBS5 mLを充填します。このプレートは37°Cで保存してください。
2. スロット付きスプーンツールを使用して、脳のスライスをインサートのメディアに入れ、スライスをゆっくりと押して完全に水没させます。すべてのスライスに対して繰り返します。
3. p1000を使用して、インサートの上部から1 mlのスライス培養培地を引き出し、ウェルの底に分注します。脳スライスの周りのアガロースのエッジが見えるまで、余分なメディアを取り出して廃棄します。残りのスライスに対してこれを行います。
4. 鉗子でインサートの縁をつかみ、傾けて余分なメディアを取り除きます。次に、インサートを1 mlのスライス培養培地を含む35 mm²ディッシュにすばやく移します。2対の鋭い鉗子を使用して、膜に伸びたり損傷したり、スライスしたり、穴を開けたりしないように注意しながら、組織の周りのアガロースを取り除きます(アガロースの縁に裂け目を付け、アガロースを両側から引き離すのが最も簡単です)。次に、インサートを6ウェルプレートに戻し、残りのスライスについても繰り返します。
5. ブロワーを外した組織培養フードで(スライスの乾燥を防ぐため)、各メンブレンからアガロース片を取り除きます。
6. ステップ1.1で調製した6ウェルプレートにスライスを移し、プレートを37°Cで保存し、スライスを24〜48時間インキュベートします。

2. スライス培養培地の変更

1. 新しい6ウェルプレートでステップ1.1を繰り返します。
2. ブロワーを外した状態で組織培養フードで、新鮮なスライス培地が入った新しい6ウェルプレートにインサートを移します。

>3. スライスへの腫瘍細胞のプレーティング

1. Cm-DiI色素を超音波処理し、中速で2分間回転させます。
2. オーバーレイに使用されている腫瘍細胞を 201 x g で 5 分間スピンダウンします。その後、2 mLのスライス培養培地に再懸濁します。
3. 2 mLの細胞および培地に7 μlのCm-DiIを加え、37°Cで20分間インキュベートします。
4. 細胞を201 x gで5分間スピンダウンし、200 μlのスライス培地に再懸濁します。細胞を解離するために穏やかに滴下し(10〜20回、またはペレットがなくなるまで)、800μlのスライス培地を加えて総容量1,000μlにします。
5. トリパンブルーを使用して生存腫瘍細胞をカウントします。緑色蛍光マイクロスフィアを細胞と同じ濃度で腫瘍細胞に加えます。これらの不活性なミクロスフェアは、コントロールとして機能します。細胞/マイクロスフェア混合物を201 x gで5分間スピンダウンし、必要な量のスライス培養培地に再懸濁します。65 μlの容量で6,000細胞/スライスの密度で細胞をプレート化します。スライスごとにプレーティングされる細胞の数は、好みや利用可能性に応じて増やすことができます。
6. 組織培養フードで、65 μlの培地/スライス中の細胞をスライスの中央に分注します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ヘープス	インビトゲン	17504044
グルコース	インビトゲン	17502048
ペニシリンストレプトマイシン	ライフテクノロジー	15140-122
HBSSの	ライフテクノロジー	14185-052
B-27	ライフテクノロジー	17504-044
N2	ライフテクノロジー	17502-048
グルタマックス	ライフテクノロジー	35050061
Neurobasal-A- ミディアムマイナスフェノールレッド	インビトゲン	12349015
低融点アガロース	プロメガ	V2111
スライスカルチャーインサート	ミリポア	PICM0RG50
ラミニン	インビトゲン	23017015
cm-ディI	インビトゲン	V22888
ミクロスフェア	ライフテクノロジー	F-21010

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