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1. MEAの準備
>注:MEAは、ガラス基板、微細加工された金属電極、およびSU-8ポリマー絶縁層で構成されています。この研究の目的のために、市販のMEAは、カスタマイズされた電極アレイレイアウトで注文されました(図1A&B)。68個の電極は、電極、電気リード線、絶縁体のない幅300μmの溝によって2つのゾーンに分割された長方形のグリッドに配置されています。各電極のサイズは40 x 40 μmで、中心から中心まで200 μmの間隔が空いています。記録部位の周囲には4つの大きな接地電極が配置されています。他の市販の標準MEAとはサイズ(21 mm x 21 mm)が異なり、固定された記録チャンバーはありません。
- 消毒のために、MEAを100%エタノール(2倍)、70%エタノール(1倍)、蒸留水(2倍)でそれぞれ少なくとも30秒間すすぎます。乾かします。清潔なガラスのシャーレ(150 mm x 25 mm)に10〜12 MEAを入れ、蓋を閉めます。
- オートクレーブMEAを120°Cで20分間、室温で保存します。
- MEA用のコーティング溶液(材料リストを参照)を調製し、アリコートを-20°Cで保存します。
- 各MEAを個別の滅菌ペトリ皿(35 mm x 10 mm)に入れます。
- 冷やしたピペットを使用して、150μlの冷やしたコーティング溶液を電極の上に置き、シャーレの蓋を閉めます。約10分後、電極の上部に気泡がないか確認し、必要に応じてゴムで覆われたヘラで静かに取り除きます。室温(RT)で1時間休ませます。
- コーティング液の残留物を吸引し、出生前および胚のニューロンに最適化された培地で1回、蒸留滅菌水で2回洗浄します。MEAを翌日まで使用しない場合は、インキュベーター内の蒸留滅菌水(O/N)に37°Cで一晩保管してください。それ以外の場合は、RTで直接乾かします。
2. 器官型培養物の調製と成長に必要な成分
- カルシウムフリーの洗浄液を準備します(材料リストを参照)。
- ニワトリ血漿を洗浄溶液(1:1、穏やかに振とう、気泡の形成を避ける)で再構成し、3,000 x gで約20分間遠心分離し、透明内容物を滅菌チューブにデカントします。200 μlをクライオチューブに分注し、-20°Cで保存します。
- それに応じてウシ血漿(200 U / ml)と滅菌フィルター(0.2 μmポアフィルター)からトロンビンを再構成します。200 μlをクライトチューブに分注し、-20 °Cで保存します。
- 30回の培養物について、100mlの栄養培地を調製します(材料リストを参照)。
3. 脊髄組織解剖
注:この手順では、胚の数にもよりますが、約25〜35の共培養物で脊髄スライスが得られ、無菌条件下で層流フード内で調製されます。
- 筋肉内注射により、致死量のペントバルビタール(0.4 ml)を母動物に適用します。.ペダル離脱反射を確認して深部麻酔を確認します。帝王切開で胚14日目(E14)ラットの胚を出産し、斬首によって犠牲にします。
- 胚の体を滅菌済みの冷やした洗浄液で満たされたペトリ皿に移します。
- 後肢の上のメスと前肢の上のメスで1回、完全な横方向のカットを行い、手足を体から取り除きます。次に、前面に切り込みを入れて、脊髄を含む背面ピースから内臓を分離します。
- スライスは、脊髄が入っているバックピースを1枚ずつ取り付けディスクに移し、ティッシュチョッパーで225〜250μmの厚さにカットします。みじん切りにしたティッシュに洗浄液を一滴垂らし、滅菌済みの冷やした洗浄液で満たされた35 mm x 10 mmのシャーレにへらでスライスを移します。
- スライスごとに別々に、残りの組織から脊髄を解剖します。後根神経節を取り付けたままにします。
- スライスを4°Cで1時間休ませます。
4. MEAへの脊髄組織スライスのマウント
- インキュベーター内の滅菌栄養培地を温めます(37°C、酸素化のために蓋を軽く緩めます)。
- 電極アレイに焦点が合った実体顕微鏡下のペトリ皿のRTに、先端がゴムで覆われた滅菌ピンセットを使用してMEAを配置します。6 μlのニワトリ血漿液滴を、清潔でほこりのない滅菌電極アレイの中央に配置します。小さなヘラを使用して、腹側が互いに向き合うように2つの脊髄部分を血漿液滴に慎重にスライドさせます。へらで電極に触れないでください。
- ニワトリの血漿液滴の周囲に8 μlのトロンビンを加えます。トロンビンピペットの先端を使用して、チキンプラズマ/トロンビン混合物を2つのスライスの周りに慎重に混合して広げます。繰り返しになりますが、脆性電極アレイに直接触れないでください。凝固の直前に、余分な鶏の血漿/トロンビンを吸引します。.
- シャーレに蓋をして高湿度を保ち、MEA/培養アセンブリをインキュベーター内の加湿チャンバーに約1時間置いて37°Cにします。
- 培養チャンバーに10μlの栄養培地を慎重に加え、シャーレに蓋をして、インキュベーターに約30分間戻します。
- 滅菌済みのゴムで覆われた先端を備えた各MEA/培養アセンブリをローラーチューブに入れ、3 mlの栄養培地を加えて蓋をしっかりと閉めます。37°Cの5%CO2含有雰囲気のインキュベーターで1〜2rpm回転するローラードラムにローラーチューブを置きます。
- 7日後、in vitro(DIV)で栄養培地の半分を交換し、その後は週に1〜2回交換します。
>5. 機械的病変
- 無菌のゴムで覆われた先端を持つMEA/培養アセンブリをローラーチューブから取り出し、組織に焦点が合った状態で実体顕微鏡下で栄養培地を含まないペトリ皿に入れます。2 つのスライスが融合していることを視覚的に確認します。
- MEAにゴムで覆われた先端のピンセットを配置して、MEA /培養アセンブリをしっかりと保持します。
- 組織スライスに近いMEAの溝にメスの刃を置きます。メスをかなり水平に持ちます。
- メスのハンドルを持ち上げますが、メスの刃をMEAの溝に留まらせて、ブレードがベースからチップに「転がり」、それによって溝を覆う組織を切り裂くようにします。
- 必要に応じて、25Gの針先で残留組織の接続を厳しくします。溝の内側の領域でのみ作業し、柔らかいエッジに触れないでください。
- MEA /培養アセンブリをローラーチューブに戻します。3 mlの新鮮な栄養培地を培養物に供給し、インキュベーターのローラードラムに戻します。
6. 自発的活動の電気生理学的記録
- 選択したDIV数後の2つの脊髄スライス間の機能再生を調べるには、MEA/培養アセンブリを顕微鏡の記録チャンバーにマウントし、約500μlの細胞外溶液を適用します(材料リストを参照)。
- 最初の録音の前に10分待って、システムが安定するまで待ちます。
- RTでMEAの各活動検出電極から約10分間、基本的な自発的な活動を2回記録します。
- 細胞外条件を安定させるためには、記録セッションのたびに細胞外溶液を交換してください。
