シングルユースバイオリアクターを用いた人工多能性幹細胞からの成熟小脳オルガノイドの作製

要約

出典: Silva, T.P., et al. Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining. J. Vis. Exp.(2020年)

このビデオでは、シングルユースの3Dバイオリアクターを使用して、人工多能性幹細胞(iPSC)から成熟した小脳オルガノイドを生成する技術を示しています。このバイオリアクターはiPS細胞凝集体の形成を促進し、その後、成長因子とケモカインを豊富に含む一連の培地で処理することで、iPS細胞凝集体の成熟小脳オルガノイドへの分化を誘導します。その後、オルガノイドを回収し、さらなる分析のために凍結保存します。

プロトコル

1. バイオリアクターにおけるヒトiPS細胞の播種

1. 単分子膜として増殖したiPS細胞を、10 μMのROCK阻害剤Y-27632(ROCKi)を添加したmTeSR1でインキュベートします。6ウェル組織培養プレートから各ウェルに1 mLの添加培地を加え、37°C、湿度95%、_CO2.
   で1時間インキュベートします 手記：ROCKiは、解離したiPS細胞をアポトーシスから保護するために使用されます。
2. インキュベーションの1時間後、各ウェルから使用済み培地を吸引し、ウェルあたり1×PBSの1mLで1回洗浄します。
3. 1 mLの細胞剥離培地(材料表を参照)を6ウェルプレートの各ウェルに加え、細胞がウェルから容易に剥離するまで、穏やかに振とうしながら37°Cで7分間インキュベー
トします。
4. 細胞が剥離して単一細胞に解離するまで、P1000マイクロピペットで細胞剥離培地を上下にピペットで動かします。各ウェルに2 mLの完全細胞培養培地を加えて酵素消化を不活性化し、細胞を滅菌コニカルチューブに穏やかにピペットで移します。
5. 210 × gで3分間遠心分離し、上清を取り除きます。
6. 細胞ペレットを培地(すなわち、mTeSR1に10 μMのROCKiを添加)に再懸濁し、トリパンブルー色素を用いた血球計算盤でiPS細胞をカウントします。
7. バイオリアクター(最大容量100 mL)に15個×10個の⁶個の単一細胞を播種し、60 mLのmTeSR1を添加し、10 μMのROCKiを最終細胞密度250,000 cells/mLで調製します。
8. iPS細胞の入った容器を、インキュベーターに設置したユニバーサルベースユニットに、37°C、湿度95%、_CO2.
   で挿入します 手記：バイオリアクターの攪拌は、ユニバーサルベースユニット制御を27rpmに設定することにより、iPS細胞の攪拌を24時間維持します。

2. 小脳オルガノイドにおけるヒトiPS細胞由来凝集体の分化と成熟

1. 単一セル シードの日を 0 日目として定義します。
2. 1日目に、血清ピペットを使用してiPSC凝集体サンプル1 mLを採取します。サンプルを収集する前に、骨材を含むバイオリアクターとユニバーサルベースユニットを無菌フローで配置することにより、以前と同様にバイオリアクターを攪拌下で維持します。細胞懸濁液を超低アタッチメントの24ウェルプレートにプレートします。iPSC由来のアグリゲートが形成されていることを確認します。
3. 光学顕微鏡で40倍または100倍の倍率で画像を取得し、骨材の直径を測定します。
4. FIJIソフトウェアを使用して、各画像の骨材の面積を測定します。
   1. 「分析 |メニューバーから「測定値の設定」をクリックし、「エリア」と「OK」をクリックします。
   2. 「ファイル|メニューバーから「開く」をクリックすると、保存されている画像ファイルが開きます。ツールバーに表示される線選択ツールを選択し、画像に表示されている縮尺記号の上に直線を作成します。「分析 |メニューバーから「スケールを設定」をクリックします。
   3. 「既知の距離」に、画像のスケールバーの範囲をμm単位で追加し、「長さの単位」をμmとして定義し、「グローバル」をクリックして設定を維持し、「OK」をクリックします。ツールバーの「楕円選択」を選択します。
   4. 骨材ごとに、楕円ツールで領域を描きます。「分析 |測定」。集合体がほぼ球形であることを考慮して、測定された面積に基づいて直径を計算します
      
      Aは骨材の面積です。
5. 骨材の平均直径が100μmの場合、使用済み培地の80%をROCKiを含まない新しいmTeSR1と交換します。凝集体の直径が200〜250 μmに達したら、すべての使用済み培地をgfCDMに交換し(表1)、オルガノイドをバイオリアクターの底に沈殿させます
   手記：平均骨材径が350μmを超える場合は、分化プロトコルを開始しないでください。単一セルの播種を繰り返します。一般的に、骨材が平均直径100μmに達するまでに約1日かかります。
6. 骨材を含むバイオリアクターを、インキュベーターに37°C、湿度95%、_{CO5 2}のユニバーサルベースユニットに挿入します。
7. バイオリアクターの攪拌を25rpmに減らします。
8. 2日目に、手順2.2、2.3、および2.4を繰り返して、骨材の直径を評価します。30 μL の FGF2 (最終濃度、50 ng/mL) と 60 μL の SB431542 (最終濃度、10 μM) を 60 mL の gfCDM 分化培地 (表 1) に加えます。バイオリアクターからの使用済み培地をすべて補充したgfCDMと交換します。手順2.6.
   を繰り返します 注:SB431542は、中胚葉分化を阻害し、神経分化を誘発するために重要です。FGF2は、神経上皮組織の尾化を促進するために使用されます。
9. 5日目に、手順2.2、2.3、2.4、および2.8.
   を繰り返します 手記：集計サイズは、差別化プロトコル中に増加する必要があります。ただし、直径が重要なのは、このパラメータが分化の有効性に影響を与える可能性があるため、分化が始まるときだけです。
10. 7 日目に、手順 2.2、2.3、2.4 を繰り返します。FGF2を希釈し、2/3にSB431542:20 μLのFGF2と40 μLのSB431542を60 mLのgfCDM分化培地に加えます。バイオリアクターから取り出したすべての使用済み培地を、補充されたgfCDMと交換します。ステップ2.6を繰り返し、バイオリアクターの攪拌を30rpmに増やします。
11. 14 日目に、ステップ 2.2、2.3、2.4 を繰り返します。60 mLのgfCDM分化培地に60 μLのFGF19(最終濃度、100 ng/mL)を加えます。バイオリアクターから取り出したすべての使用済み培地を、FGF19を添加したgfCDMと交換します。手順2.6.
    を繰り返します 手記：FGF19は、中脳後脳構造の分極を促進するために使用されます。
12. 18 日目に、手順 2.2、2.3、2.4、2.11 を繰り返します。
13. 21 日目に、手順 2.2、2.3、2.4 を繰り返します。バイオリアクターから取り出したすべての使用済み培地を完全な神経基礎培地と交換します(表1)。手順2.6.
    を繰り返します 手記：神経基礎培地は、オルガノイド内の神経細胞集団を維持するために使用される基礎培地です。
14. 28 日目に、手順 2.2、2.3、2.4 を繰り返します。180 μL の SDF1 (最終濃度、300 ng/mL) を 60 mL の完全神経基礎培地に加えます。バイオリアクターから取り出したすべての使用済み培地を、SDF1を添加した完全な神経基礎培地と交換します。手順2.6.
    を繰り返します 手記：SDF1 は、異なるセル層の編成を容易にするために使用されます。
15. 35 日目に、ステップ 2.2、2.3、2.4 を繰り返します。バイオリアクターから取り出したすべての使用済み培地を完全なBrainPhys培地と交換します(表1)。手順2.6.
    を繰り返します 手記：BrainPhysは、シナプス的に活動するニューロンをサポートするニューロン媒体です。
16. 分化の90日目まで、3日ごとに総量の1/3を完全なBrainPhys培地に交換します。

>表1:ストック溶液と培地の準備。 iPS細胞の維持・分化プロトコル用の培地調製に使用されたすべての成分と容量、および成長因子と低分子のストック溶液がリストされています。ストック溶液については、すべてのストック濃度と再構成のプロトコルがリストされています。

てください 。 。 します

>メディアの準備	mTeSR1 最終容量:500 mL	1. mTeSR1 5×サプリメントを室温(RT)または4°Cで一晩解凍し、基礎培地 と混合します 2. 完全なmTeSR1培地を4°Cで最大2週間保存するか、40 mLのアリコートを調製して-20 °C で保存します。 3. 使用前にRTで完全なmTeSR1を温めておい
	gfCDM(成長因子フリーの既知組成培地) 最終容量:60 mL	30 mL Ham's F12 30 mL IMDM 600 μL 既知脂質濃縮液 (1 % v/v) 2.4 μL モノチオグリセロール (450 μM) 30 μL アポトランスフェリン (30 mg/mL 水溶液、最終濃度:15 μg/mL) 300 mg 結晶化精製 BSA (5 mg/mL) 42 μL インスリン (10 mg/mL のストック濃度、 最終濃度:7 μg/mL) 300 μL P/S (0.5% v/v, 50 U/ml ペニシリン/50 μg/ml ストレプトマイシン)
	ニューロベース<BR /> 最終容量:60 mL	60 mL のニューロベース培地 600 μL N2 サプリメント 600 μL グルタマックス I 300 μL P/S (0.5 % v/v)。
	コンプリートBrainPhys 最終容量:60 mL	60mL BrainPhys 1.2 mL NeuroCult SM1 Neuronal Supplement 600 μL N2 Supplement 12 μL BDNF (最終濃度:20 ng/mL) 12 μL GDNF (最終濃度:20 ng/mL) 300 μL ジブチリル-cAMP (ストック濃度:100 mg/mL in water, final concentration: 1 mM) 42 μL アスコルビン酸 (Stock concentration: 50 μg/mL in water, 最終濃度:200 nM)
成長因子と低分子のストック溶液	基礎線維芽細胞増殖因子(bFGF/FGF2) ストック濃度:100 μg/mL	1. 5 mM Tris、pH 7.6、10 mg/mL で再構成します。 2. 0.1 % BSA含有PBS(v/v)で希釈し、最終ストック濃度100 μg/mLにします
	間質細胞由来因子1(SDF1) ストック濃度:100 μg/mL	1. 10 mg/mL の濃度で水に溶解します 2. PBS中の0.1 % BSA(v/v)で希釈し、最終ストック濃度を100 μg/mLにします。
	脳由来神経栄養因子(BDNF) ストック濃度:100 μg/mL<
	グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF) ストック濃度:100 μg/mL
	線維芽細胞増殖因子19(FGF19) ストック濃度:100 μg/mL	1. 5 mMリン酸ナトリウム、pH 7.4、10 mg / mL / mL / >で再構成< 2. 0.1 % BSA含有PBS(v/v)で希釈し、最終ストック濃度100 μg/mLにします
	ROCK阻害剤 Y-27632 原液濃度:10mM	10 mMの濃度でDMSOで再構成します。
	SB431542 原液濃度:10mM
	インスリン ストック濃度:10 mg/mL	1. 10 mM NaOH 300 μL に 10 mg のインスリンを再構成します 2. 溶液が透明になるまで、1 M NaOHを慎重に添加 3.滅菌水で1mLまで充填

>表2:凍結切片および免疫染色用のオルガノイド調製用溶液。 凍結切片および免疫染色用のオルガノイドの調製に使用される溶液の調製に使用されたすべての成分と容量がリストされています。

トします

ゼラチン/ショ糖 最終濃度:7.5%/ 15%w / w / w

1. 15 gのスクロースと7.5 gのゼラチンを滅菌ショットガラス瓶に入れ、よく混ぜ 2. PBS 1×を65°C で予温します 3.予熱したPBS 1×を最終重量100 gに加え、よく混ぜ 4. ショットガラスボトルを65°Cの加熱プレートに入れ、ゼラチンが溶けるまで振 5. 溶液が安定するまで37°Cでインキュベー

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1キット	5793〜500mL	幹細胞技術
既知組成の脂質濃縮物	11905031	サーモフィッシャー
結晶化精製BSA	5470	シグマ
DMEM-F12	〒32500-035	サーモフィッシャー
ウシ胎児血清	A3840001	サーモフィッシャー
ウシの皮からのゼラチン	G9391	シグマ
グルタマックスI	〒10566-016	サーモフィッシャー
ジブチリルcAMP	SC- 201567B -500mg	フリラボ
ハムのF12	21765029	サーモフィッシャー
ヒトエピソームiPS細胞株	A18945の	サーモフィッシャー	iPSC6.2 (英語
IMDM	12440046	サーモフィッシャー
インスリン	91077C	シグマ
iPSのDF6-9-9T.B		ウィセル
イソペンタン	PHR1661-2ML	シグマ
L-アスコルビン酸	A-92902	シグマ
マトリゲル	354230	コーニング	基底膜マトリックス
モノチオグリセロール	M6154	シグマ
mTeSR1	85850 -500ミリリットル	幹細胞技術
N2サプリメント	17502048	サーモフィッシャー
神経基礎	12348017	サーモフィッシャー
パラホルムアルデヒド	158127	シグマ
PBS-0.1 シングルユース容器	商品コード: IA-0.1-D-001	PBSバイオテクノロジー
PBS-MINI MagDriveベースユニット	商品コード: IA-UNI-B-501	PBSバイオテクノロジー
組換えヒトBDNF	450から02	ペプロテック
組換えヒトbFGF/FGF2	100-18B	ペプロテック
組換えヒトFGF19	100〜32	ペプロテック
組換えヒトGDNF	450から10	ペプロテック
組換えヒトSDF1	300-28A	ペプロテック
ROCK阻害剤	Y-27632 72302	幹細胞技術
SB431542	S4317	シグマ
蔗糖	S7903	シグマ
Tissue-Tek O.C.T.コンパウンド	25608から930	VWRの

学 名 の 版) の