マウスの脳からの腫瘍浸潤免疫細胞の単離

要約

出典: Baker, G. J., et al., Lowenstein, P. R. Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells. J. Vis. Exp. (2015年)

このビデオは、機械的解離と酵素消化を使用して、マウスの脳から腫瘍浸潤末梢血単核細胞を分離する方法を示しています。これに続いて、密度勾配遠心分離を行い、免疫細胞を採取してさらに分析します。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

滅菌プラスチック容器に90mlの10x PBSを264mlの超純脱イオン水(3.93x)に入れて、密度遠心分離培地混合溶液を調製します。HClでpH 7.0-7.2に滴定し、0.22μmのフィルターでフィルター滅菌します。4°Cで保存してください。

18 mLの密度遠心分離培地混合溶液と30 mlの密度遠心分離培地(詳細については材料リストを参照)を50 mLのポリプロピレン遠心チューブに組み合わせて、70%密度の遠心分離培地を準備します。4°Cで保存しますが、使用前にRTに持参してください。

50 mLの遠心チューブに9.6 mlのDPBSと10.4 mLの70%密度遠心培地を組み合わせて、37%密度の遠心分離培地を準備します。4°Cで保存しますが、使用前にRTに持参してください。

1. 神経膠腫浸潤PBMCの分離

1. 清潔な片刃のカミソリの刃を使用して、脳の中心を矢状に切り込み、2つの半球を二等分することにより、腫瘍を含む脳の領域を分離します。同側半球の内側を下にして、小脳と嗅球のレベルで2つの冠状切開を行い、腫瘍インプラントを含む標的組織を分離します(図1A)。対側半球の同等の部分も分離され、ネガティブコントロールとして使用できます。
2. ターゲット組織を、1 mlのDPBSを含むそれぞれラベル付けされたガラス製Dounceティッシュグラインダーに入れ、プランジャーを完全に押し下げ、7回ひねって最初に組織を破壊します。プランジャーを持ち上げて、液体がティッシュグラインダーの底に戻るようにします。この手順を 3 回繰り返します。ただし、プランジャーをひねるのは、次の2回の繰り返しで4回、最後の繰り返しで3回だけひねって、組織の過度の粉砕を避けてください。
3. P-1000マイクロピペットを使用して、プランジャーの側面に沿って氷冷したDPBSを1mlの量3つを順次塗布し、ティッシュグラインダーですすぎます。
4. 粉砕された脳内物質をピペッティングで上下させ、氷上の標識された15 mL遠心チューブに入れて再懸濁します。Dounceティッシュグラインダーの側面を氷冷DPBS1 mlで洗い流し、同じ15 ml遠心分離チューブに追加します。すべてのサンプルが処理されるまで、粉砕された脳内物質を含むすべてのチューブを氷上に置いておきます。
5. すべてのサンプルを処理したら、15 mLの遠心分離チューブ内で粉砕された脳内物質を740 x g(最大RCF)で4°Cで20分間スピンダウンします。
6. 10 mLの血清ピペットとピペットガンで上清を取り除き、P-1000を使用して、以前に調製したコラゲナーゼ/ DNase-I消化酵素1 mLにペレット化された脳物質を再懸濁します。.15 mLの遠心分離チューブを試験管ラックに入れ、37°Cのウォーターバスに15分間入れます。
7. インキュベーション期間中、チューブをフリックしてサンプルを2回穏やかに攪拌し、組織の解凝集を促進します。
8. 10 mLの血清学的ピペットを使用して6 mlの氷冷DPBSを各チューブに加え、消化酵素を希釈します。.ピペットで上下させて再懸濁し、滅菌済みの70μmナイロンメッシュフィルターで総容量をろ過し、氷上の新しいラベル付き15ml遠心分離チューブに入れます。
9. 脳細胞懸濁液を740 x g(最大RCF)で4°Cで20分間回転させ、シングルセルペレットを作製します(図1B)。遠心分離機から15 mLチューブを取り出した後、氷の上に置き、遠心分離機の温度設定を約21°Cに上げて、次のステップに備えます。
10. 脳細胞を含む各チューブから上清を完全に除去し、最初にP-1000マイクロピペットを使用してペレットを70%密度遠心培地1 mLに再懸濁します。次に、10 mLの血清ピペットを使用して、各チューブに70%密度の遠心分離培地を4ミリリットル追加します。キャップをしっかりとねじ込み、チューブに数回静かに反転させて細胞懸濁液を均質化します。
11. 70%密度の遠心分離培地に再懸濁した脳細胞が入った15 mLの遠心分離チューブを氷から取り出し、RTの試験管ラックに入れます。一度に1つずつ、2 mLの37%密度遠心分離培地溶液を5 mLの70%遠心分離培地にP-1000マイクロピペットで慎重に重ねて、2つの密度遠心分離培地層間にクリーンな界面を形成します(図1C)。
    1. 先端の細いマーカーを使用して界面の位置を示すと、遠心分離後に区別がわからなくなったときに簡単に識別できます。
12. 15 mLの遠心分離チューブを740 x g(最大RCF)でRTで20分間スピンダウンし、界面の破壊を避けるために休憩なしで回転させます。
13. 遠心分離後、2つの密度遠心分離培地層(図1D)間の界面に蓄積したPBMCを、P-200マイクロピペットをその側面に沿ってチューブに導入し、脂質層を慎重にバイパスして収集します。
    1. PBMCバンドのレベルに達したら、密度70%の遠心分離培地層の表面から200 μlをゆっくりと抽出し、氷上のそれぞれにラベル付けされたポリプロピレンFACSチューブに入れます。サンプルあたり合計容量400μlに対して1回繰り返します。
14. 400 μlのPBMCを含む各FACSチューブに3 mLのフローバッファーを加えて、密度遠心分離培地を十分に希釈し、細胞を660 x g(最大RCF)で4°Cで20分間スピンダウンします。

結果

図1:神経膠腫浸潤PBMCの分離。(A)初期同所性神経膠腫インプラントを含むマウス脳組織の解剖戦略。トップパネルは、同側半球が対側半球から離れて矢状二分であることを示しています。底面のパネルは、腫瘍インプラントを含む標的組織を分離するために必要な2つの追加の冠状切開を示しています(紫色で強調表示)。(B)酵素消化後のシングルセル脳組織ペレット(白矢印)、70μmナイロンメッシュによるろ過、および遠心分離後。(C)遠心分離前に適切に注がれた密度遠心分離培地勾配。白い矢印は、2つの密度遠心分離媒体層の間に形成されたクリーンな界面を示しています。(D)37%密度遠心培地層の上部に形成される脂質層(白矢印)と2つの層間の界面のPBMCバンド(黒の破線で囲まれた部分)を示...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ダルベッコのイーグルスミディアムの修正	ギブコ	〒12430-054	4.5g/L D-グルコース、L-グルタミン、25mM HEPES、フェノールレッド
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水	ギブコ	14190-144	塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムなし
ウシ胎児血清	オメガサイエンティフィック株式会社	FB-11
ペニシリンストレプトマイシン	ギブコ	15140-122	10,000U/ml ペニシリン; 10,000μg/ml ストレプトマイシン
0.6mlコニカルポリプロピレンMIマイクロチューブ	ジェネシー・サイエンティフィック	22から272
ポリウレタンアイスバケツ	フィッシャーブランド	02-591-45	容量:0.152オンス(4.5L)
コラゲナーゼ(I-S型)	シグマ・アルドリッチ	C1639	Clostridium histolyticumから
デオキシリボヌクレアーゼI	ワージントンバイオケミカルコーポレーション	LS002007	>2,000クニッツ単位/mg乾燥重量
大型解剖ハサミ	テッド・ペラ株式会社	1316
小型解剖ハサミ	FSTの	14094-11
鈍い端の鉗子	テッド・ペラ株式会社	13250
7mlガラスダウンティッシュグラインダー	コンテス	KT885300-0007
Percoll Density 遠心分離培地	GEヘルスケア	GE17-0891-01
10 mLセロロジカルピペット	ジェネシー・サイエンティフィック	12〜104	シングルユース;滅菌済み
70μm滅菌ナイロンメッシュセルストレーナー	フィッシャーブランド	22363548
15mlポリプロピレン遠心分離管	ジェネシー・サイエンティフィック	21〜103	円錐形の底
50mlポリプロピレン遠心分離管	ジェネシー・サイエンティフィック	21〜108	円錐形の底
12x75mm丸底ポリプロピレンFACSチューブ	フィッシャーブランド	14-956-1B

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