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サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。
1. 器具、培地、食器の準備
- 2つのステンレス鋼の実験室解剖はさみと2つのステンレス鋼の実験室鉗子を準備します。すべての器具をオートクレーブし、紫外線(UV)光の下で培養フードO / Nに入れて滅菌します。
- 500 mLの最小必須培地(MEM)培養培地(10% Fetal Bovine Serum [FBS]、20 mM KCl、25 mM NaHCO3、30 mM D-グルコース、2 mM L-グルタミン、100 U/mlペニシリン、100 μg/mlストレプトマイシン、6 μg/mlアンピシリン)を調製し、滅菌をろ過します。4°Cで数ヶ月間保存してください。
- 厚さ14mmのカバースリップ1を含む24枚のウェル培養プレートを調製します。カバースリップをオートクレーブし、100 mg/Lポリ-d-リジン(PDL)でコーティングします。UVライトはO / Nを滅菌します。
>2. 小脳顆粒細胞(CGC)培養液の調製
- 250 mg のグルコース、300 mg のウシ血清アルブミン [BSA]、955 mg のリン酸緩衝生理食塩水 [PBS] (Ca2+ および Mg+ フリー)、および 1 ml の 3.8% MgSO4·7H2O を含むオートクレーブ滅菌 UV 光処理滅菌 dH2O 中の「溶液 A」(100 mL)を調製します。
- 9 mlの溶液Aで希釈した1 mlの5 mg / mlトリプシンを含む「溶液B」(10 ml)を調製します。.
- 1,000ユニットのDNase、0.5 mgの大豆トリプシン阻害剤、100 μlの3.8% MgSO4·7H2Oを含む「溶液C」(10 mL)を調製し、溶液Aで10 mLに希釈します。
- 3.2 mlの溶液Cを含む「溶液D」(20 ml)を調製し、溶液Aで20 mlに希釈します。
- EBSS、25 mM NaHCO3、3 mM MgSO4·7H2O、および4% BSA、pH 7.4を含むBSA/Earle's Balanced Salt Solution(EBSS)溶液を調製します。
- L-ロイシンメチルエステル(LME)を調製するには、純粋なLMEを5 mLのMEM培地に添加して最終濃度を150 mM LMEにした後、ベンチトップpHメーターを使用して溶液をpH 7.4に戻し、28 mmポリエーテルスルホン(PES)0.2 μmシリンジフィルターを使用してろ過滅菌します。
3. CGCの培養
- 生後4〜7日のラットの子犬から小脳を収集します。氷の上に5mlの溶液Aが入ったシャーレにすぐに入れます。
- 小脳から余分な溶液を注ぎ、組織をペトリ皿の蓋に入れます。
- よく燃え上がったかみそりの刃で、少なくとも3つの異なる方向に組織を細かく刻みます。
- みじん切りにしたティッシュを溶液Bに加え(限られた組織が失われるように、ペトリ皿を溶液ですすいでください)、37°Cの水浴に5分間入れます。
- 溶液D(20 ml)をチューブに加えてトリプシンを中和し、振とうし、65 x gで5分間遠心分離します。
- 上澄みを注ぎます。
- 4 mLの溶液C.Triturateに、直径が小さくなる3つの炎状ガラスピペットで(各約10回)よく再懸濁し、懸濁液ができるだけ均一になるまでします。
- このホモジネートをBSA/EBSSの上にゆっくりと穏やかに数滴加えます。BSA/EBSSを通って沈み始めた場合は、さらに回転させるか、溶液Cを少し追加します。ホモジネートは、BSA/EBSSの上の層に配置する必要があります。振らないでください。100 x gで5分間遠心します。
- 上清を取り除き、ペレット(軟質)を1 mLのMEM培地に再懸濁します。
- 血球計算盤とプレートを使用して、500 μlのMEM培地に800,000細胞/カバースリップで細胞をカウントします。6% CO2 を含む 37 °C のインキュベーターに入れます。
- 翌日(準備の24〜36時間後)に培地を交換します。細胞周期阻害剤アラビノフラノシルシチジン(AraC)を10 μM含有するMEM培地の溶液を調製します。
- 各カバースリップについて、250 μlの古い培地を新しい24ウェルプレートに保持し、残りを吸引し、250 μlの通常のMEM培地を加え、これを吸引して細胞を洗浄します。次に、250 μlの古い培地を細胞に戻し、250 μlのAraC含有培地を補充します
手記：細胞はin vitro(DIV)で6日間使用できます。
4. ミクログリアを選択的に枯渇させる (6 DIV で実行)
- 純粋なLMEを5 mLの別個のMEM培地に添加して、最終濃度150 mM LMEを得ます。
- 溶液をpH 7.4に戻し、28 mmポリエーテルスルホン(PES)0.2 μmシリンジフィルターを使用してフィルター滅菌します。
- MEM培地で溶液を50 mM(2 x LME)の濃度に希釈し、コントロール培養用の通常のMEM培地とともに37°Cの水浴に10分間置きます。
- MEM培地の半分 (250 μl) をCGC培養物から取り出し、37 °Cで保存します。
- 細胞を 2 x LME (250 μl) 含有 MEM 培地、すなわち 1:1 に希釈してウェル濃度 25 mM にするか、LME を含まない予熱 MEM 培地 (250 μl) で細胞を処理 (コントロール培養用)。
- 細胞を37°Cで6%CO2を含む加湿雰囲気で1時間インキュベートします。
- 温めた新鮮なMEM培地で細胞を2回洗浄してLME含有培地を除去し、保持した培地と同量の温めた新鮮なMEM培地を対応するウェルに交換します。
- 培養物をインキュベーターに戻し(37°Cで6%CO2で加湿)、24時間休ませてからさらに処理します。