ラット脳由来グリア細胞の三次元培養法の確立

要約

出典:Koss, K. M, et al. 神経炎症のインビトロモデリングのための初代グリア細胞の3Dハイドロゲル培養の改善

。

このビデオでは、グリア細胞の三次元培養を確立する技術を示しています。ラット脳由来のグリア細胞は、細胞外マトリックス成分を含む光架橋性ポリマーマトリックス内にカプセル化されています。増殖培地でインキュベートすると、グリア細胞は支持マトリックス内で増殖し、三次元培養を作製します。

プロトコル

1日目のSprague Dawleyラットの子犬の脳組織抽出のプロトコルは、アルバータ大学の動物管理および使用委員会によって承認されました。

1. ミクログリアとアストロサイトの分離

>注:単離および細胞培養用のすべての培地は、水浴中で37°Cに予熱されます。ハンク平衡塩溶液(HBSS)には、1%のペニシリン-ストレプトマイシン(PS)が含まれています。ハムのF12栄養混合物(DMEM / F12)を含むすべてのダルベッコの改変イーグル培地には、10%のウシ胎児血清(FBS)と1%のペニシリン-ストレプトマイシン(PS)が補充されています。トリプシンとの混合物のみがFBSを欠いています。このプロトコルのすべての材料は無菌(フィルター、アルコール、購入済み、オートクレーブ済み)であり、ステップ番号1.8以降のすべてのステップは、無菌技術を使用してバイオセーフティキャビネットで実行されます。

1. 脳あたり、15 mLのHBSSと12.5 mLのDMEM / F12を50 mLのコニカル遠心チューブで37°Cに予熱し、約2 mLの0.25%トリプシンと1 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を15 mLのコニカル遠心チューブで予熱します。.さらに25mLのDMEM/F12を加熱します。酵素活性の損失を防ぐために、使用の約10分前にトリプシンを温めてください。
2. 表面を覆うように、滅菌済みの6cmおよび10cmの培養皿に十分な温かいHBSSを注ぎます。2つの脳ごとに10cmの皿を1つ準備し、さらに6cmの皿を準備します。
3. 各10cm2皿に最大2つの脳を置きます(図1A)。
4. 解剖顕微鏡下で、湾曲したまっすぐな鉗子を使用して、正中線に沿った皮質と脳幹のある小脳を分離します。これにより、脳ごとに3つの組織切片が得られます(図1B)。
5. 組織の各切片から血管を含む組織の薄い半透明の層(髄膜)をはがして廃棄し、残りの組織を別の培養皿に移します。組織の切り傷によって露出した薄い層を鉗子でつかみ、主要な部分が脳組織から「ぶら下がっている」まで慎重に引っ張ります。最後に、軽く引っ張ってこの部分を取り除きます。この手順の実行前、手順の実行中、および実行後の代表的なイメージについては、図 1C-1E を参照してください。
6. バイオセーフティキャビネットで、残りのHBSSを培養皿から取り出し、組織を慎重に保持します。メスで組織を浸軟させ、トリプシンで事前に温めた15mLチューブに組織を移します。.
7. このチューブを37°Cの浴中で25分間インキュベートし、組織を酵素的に消化します。
8. チューブを500 x gで室温で2分間遠心分離し、上清を注ぎます。
9. 10 mLの血清ピペットを使用して、10 mLの温かいDMEM / F12を加えてトリプシンを不活性化し、溶液を5回漸減して組織を分解します。
10. チューブを500 x gで室温で2分間遠心分離し、上清を注ぎます。
11. 10 mLの血清ピペットを使用して、ペレットを10 mLの温かいDMEM/F12に再懸濁し、溶液を50 mLのコニカル遠心チューブに移します。
12. 18ゲージの針が付いた10mLシリンジを使用して、溶液を3回粉砕します。
13. この溶液を脳あたり12.5mLの温かいDMEM / F12の増分に分配します。.
14. トリチュレート溶液を1mLずつ12ウェルプレートにピペットで移します(脳あたり1
枚)。
15. 加湿細胞培養インキュベーターで37°Cおよび5%CO₂でインキュベートします。3 日後にメディアを交換し、その後 3 日ごとにメディアをリフレッシュします。2週間後、細胞を採取して実験を行うことができます。

2. マクロマー合成

1. 50 mLのコニカル遠心チューブに375 mgのヒアルロン酸(HA)塩を秤量し、蒸留水37.5 mLを加えます。
2. 溶液をボルテクサーで1分間洗い流し、混合物が均一に見え、ゲル状の粘度を失うまで混合物を超音波処理します。このプロセスには6時間かかる場合があります。
3. マグネチックスターバー(38mm)付きの100mLビーカーに溶液を移し、室温で激しく撹拌します。
4. 5.0 M NaOHを混合HAに慎重に滴定し、pHが8〜12の間で安定するまでpHペーパーで測定します。
5. 保存中に窒素で覆われた新鮮な無水メタクリル酸メタクリル酸(MA、94%)を3mL収集します
   手記：MAは長時間(数日)大気にさらされると、反応性が失われます
   注意：MAのすべての使用はドラフトで行う必要があります。
6. 200 μL の MA を混合 HA 溶液に加えます。この反応により、溶液のpHが8未満に低下します。
7. 3mLのMAを溶液に加えるまで、手順2.4〜2.6を繰り返します。このプロセスには最大1〜2時間かかる場合があります。
8. 反応を混合せずに4°Cで一晩続けます。
9. 500mLビーカーで溶液を400mLの冷エタノール(EtOH)に移し、4°Cで24〜72時間沈殿させます。
10. 溶液の大部分を別のビーカーに慎重にデカントして廃棄し、沈殿物を50 mLの円錐形遠心チューブに回収します。これは、必要に応じて2〜4本のチューブに分配することができます。
11. チューブを200 x gの遠心分離機で室温で2分間遠心分離し、上清を廃棄します。
12. チューブに冷たいEtOHを補充し、溶液をボルテクサーで1分間混合し、ステップ2.10〜2.11を繰り返します。
13. 滅菌脱イオン水25 mLを加え、溶液をボルテクサーで1分間混合し、超音波処理(>20 kHz)で1時間、4°Cで一晩インキュベー
トします。
14. 溶液を-80°Cの冷凍庫に15分間、または液体窒素で凍結または急速凍結するまで置きます
    注意：液体窒素を使用する場合は、保護手袋、フェイスシールド、エプロンを使用してください。
15. チューブを凍結乾燥(0.1 mBarおよび-30°C未満)し、雪のような粉末が生成されるまで24〜48時間
。
16. この時点で、¹H 核磁気共鳴によってサンプルの純度を試験し、HA 骨格上のメチルプロトン(1.9 ppm)に対するメタクリレートプロトン(6.1 ppm と 5.6 ppm のピーク)の量を確認できます。メチルプロトンに対するメタクリレート95%の最小比率が許容されます。

3. ゲル形成と3Dカプセル化

1. カバースリップと金型の準備
   1. 50 mLの円錐形遠心分離チューブで、2%3-(トリメトキシシリル)プロピルメタクリレートの50 mL蒸留水溶液を作ります。
   2. 18 mmのガラスカバースリップを溶液に入れ、室温で1時間揺さぶります。一度に最大50枚のカバースリップを追加できます。
   3. カバースリップを100mLの脱イオン水の3つのビーカーにそれぞれ連続して浸してすすぎます。.
   4. カバーガラスを40°Cの真空でデシケーターとオーブンで一晩乾燥させます。
   5. 鉗子を使用して、個々のカバーガラスを70%EtOHにすばやく浸します。
   6. 乾燥させずに、各カバースリップを12ウェルプレートのウェルに落とします。
   7. 滅菌脱イオン水(ウェルあたり1 mL)で各ウェルを洗浄し、吸引します。
   8. 滅菌済みの2 μg /mLポリ-L-リジン(PLL)1 mLを各ウェルに加え、>2時間インキュベー
   トします。
   9. PLL溶液を吸引し、カバーガラスを風乾させます。
   10. ポリジメチルシロキサン(PDMS)モールド(図2を参照)を70%EtOHに浸し、各カバースリップの中央に1つずつ置き、風乾させてモールドとガラスの間にシールを作成します。
       1. 平底ポリスチレン皿にPDMSプレミックス試薬を10:1の比率で鋳造することにより、PDMSモールドを調製します。調製したPDMSの量は、厚さ約1mmのシートが得られるように選択されます。PDMSでウェルを形成するには、内径10のサークルパンチでシートをカットします。
2. 細胞調製
   注:プロトコルのすべてのステップは、バイオセーフティキャビネット内で滅菌技術で実行されます。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)は、すべてのステップでpH 7.4に調整されます。
   1. メタクリル化ヒアルロン酸(HAMA)に細胞をカプセル化する24時間前に、12ウェルプレートの2週間の初代培養(ステップ1.15から)の培地をリフレッシュします。1ウェルあたり1 mLのDMEM/F12(10% FBSおよび1% PS)培地を添加します。
   2. 細胞の12ウェルプレートごとに、12.5 mLの希釈トリプシン(0.25%トリプシン-EDTAをDMEM/F12培地で30%希釈)と25 mLのDMEM/F12(10%FBSおよび1%PS)を調製し、水浴で37°Cで温めます。
   3. 10 mLの血清ピペット(ウェルあたり> 0.5 mL)を使用してプレートから馴染んだ培地を回収し、残りの液体を完全に吸引し、希トリプシン(0.075%トリプシン-エチレンジアミン四酢酸[EDTA])のウェルあたり1 mLとインキュベーター(37°C、5%CO₂)で20〜30分間、コンフルエントセル層がプレートから剥離するまで交換します。
   4. 1 mLピペット(1つの浮遊片として表示)で懸濁細胞材料を回収し、15 mLの円錐形遠心チューブに回収します。等量のDMEM/F12(10%FBSおよび1%PS)で希釈し、室温で200 x gで2分間遠心分離し、上清を捨てます。
   5. 細胞ペレットを10 mLの温かいDMEM/F12(10% FBSおよび1% PS)に再懸濁し、10 mLピペットで細胞を5回粉砕し、200 x gで2分間遠心分離します。
   6. 上清をデカントし、細胞を5 mLの温かいDMEM/F12に再懸濁し、細胞を50 mLの円錐形遠心チューブに移します。
   7. 18ゲージの針が付いた10mLシリンジを使用して、細胞溶液を3回粉砕し、懸濁液を40μmの細胞ふるいで新しい円錐形の遠心分離チューブにろ過します。
   8. 10 μLの細胞懸濁液を回収し、温かいDMEM/F12で1:100に希釈し、自動セルカウンターで細胞をカウントします。
   9. カプセル化ステップまで37°Cの水浴でインキュベートします。
3. 細胞カプセル化
   注:プロトコルのすべてのステップは、バイオセーフティキャビネット内で滅菌技術で実行されます。
   1. 3Dハイドロゲルの12ウェルプレートごとに、細胞調製中に回収した12.5 mLのDMEM/F12と12.5 mLのコンディショニングDMEM/F12培地を温めます。
   2. 最終濃度0.5%重量/体積に必要なHAMAの量を秤量し、このHAMAを滅菌ろ過PBSに溶解し、(2%重量/体積)の濃度で最終濃度の4倍以上の濃度で細胞や他の試薬の添加に対応します。12ウェルプレートのハイドロゲル1枚には、~350 μL PBSと7 mg HAMAが必要です。
   3. HAMAが60分間完全に溶解するまで、溶液(>20 kHz)を超音波処理します。
   4. トリエタノールアミン(TEA)と1-ビニル-2-ピロリジノン(NVP)の両方の個々の10%溶液、およびエオシンY(EY)の1 mM溶液を滅菌PBS pH 7.4の1 mLアリコートに調製します。
   5. 1つの12ウェルプレートについて、1 x 10⁷細胞、0.5% wt/vol HAMA (350 μL of 2% wt/vol)、0.1% TEA (14 μL of 10%)、0.1% NVP (14 μL of 10%)、および 0.01 mM EY (14 μL of 1 mM)、および 20% 基底ラミナ混合物 (ストック 280 μL ) の最終的な 1.4 mL 混合物を作成します。残りのボリュームはPBSです。
   6. 溶液とピペット100μLを1 mLチップで各PDMS型に静かに混合します。
   7. サンプルを高輝度の緑色LEDライト(~520 nm、60 mW、密閉された20 cm x 20 cm x 20 cmの箱)に室温で5分間さらします。
   8. 温冷したDMEM/F12のウェルあたり1 mLを12ウェルプレートに加えます。
   9. 親指と人差し指で各カバースリップをつかみ、ゲルがずれないように注意しながら、湾曲したピンセットでPDMSの型をゆっくりと剥がし、調整された培地の入ったウェルに入れます。
   10. 各ウェルにさらに1 mLの温かいDMEM/F12を加えます。
   11. プレートを5% CO₂で37°Cで2週間インキュベートし、各ウェルから1 mLの培地をピペッティングし、1 mLのDMEM/F12と交換して、細胞培地を毎週リフレッシュします。

結果

図1:1日目のSprague Dawleyラットの子犬の脳の解剖。全脳の画像(A)、皮質と小脳の解剖(B)、髄膜のある単一の皮質(C)、鉗子による髄膜の剥離(D)、および髄膜のない皮質(E)。

図2:メタクリル化ヒアルロン酸(HAMA)ベースの3D細胞培養および光重合プロトコルの概略図。グリア細胞(2週間の初代ラット脳培養)をHAM...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1. HAMA合成・光重合用材料
ヒアルロン酸(HA)	シグマ・アルドリッチ	53747から10G	Streptococcus equi, MW: 1.5 - 1.8 X 10^6
無水メタクリル酸(MA)	シグマ・アルドリッチ	275585-100ミリリットル
水酸化ナトリウム(NaOH)	シグマ・アルドリッチ	221465から25G
エタノール(EtOH)	コミリカルアルコールズ株式会社		無水
リン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4)錠剤	フィッシャーサイエンティフィック	18912014
トリエタノールアミン(TEA)	シグマ・アルドリッチ	90279-100ミリリットル
1-ビニル-2ピロリジノン(NVP)	シグマ・アルドリッチ	V3409-5Gの
エオシンY(EY)	シグマ・アルドリッチ	E6003-25G
ポリジメチルシロキサン(PDMS)シルガード184シリコーンエラストマーキット	ダウコーニング
3-(トリメトキシシリル)メタクリレートプロピル	シグマ・アルドリッチ	440159から100ミリリットル
ビーカー(100mL)	コーニング	1000〜100
ビーカー(500mL)	コーニング	1000〜600
pHペーパー(Labstick)	シグマ・アルドリッチ	9580
2. グリア細胞の単離と細胞培養のための材料
P1-2 スプレイグ・ドーリー・ラットの子犬	チャールズ川	CDスプレイグDawleyラット株コード001
ディセクタハサミ - スリムブレード(小)	ファインサイエンスツール	14081-09
手術用ハサミ - タフカット(大)	ファインサイエンスツール	14130-17
細い鉗子(デュモン#5)	ファインサイエンスツール	11521-10
湾曲した細い鉗子(デュモン#7)	ファインサイエンスツール	11271-30
ハンクの平衡塩溶液(HBSS)	ギブコ	14170-112
ダルベッコの改変イーグルの培地とハムの栄養素混合物F-12(DMEM / F12)	ギブコ	〒11320-033
ペニシリン-ストレプトマイシン(PS)	ギブコ	15140-122
ウシ胎児血清(FBS)	ギブコ	〒12483-020
0.25%トリプシンエチレンジアミン四酢酸(EDTA)	ギブコ	〒25200-072
ポリ-L-リジン(PLL)	シグマ・アルドリッチ	P-6282
50 mLコニカル遠心チューブ	フィッシャーサイエンティフィック	05-539-13
15 mLコニカル遠心チューブ	フィッシャーサイエンティフィック	05-539-5
12ウェル組織培養処理プレート(セルスター)	グライナーバイオワン	665 108
10 mL血清ピペット	フィッシャーサイエンティフィック	13-676-10F
25 mL血清学的ピペット	フィッシャーサイエンティフィック	12-676-10K
ペトリ皿(60mm×15mm)	フィッシャーサイエンティフィック	FB0875713A
ペトリ皿(100mm×15mm)	フィッシャーサイエンティフィック	FB0875712
顕微鏡カバースリップ(18 mm)	フィッシャーサイエンティフィック	12-545-100 18CIRの