ヒト多能性幹細胞を用いたアストロスフィアの生成と維持

Abstract

出典: Cvetkovic, C., et al. Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp.(2018年)。

このビデオは、ヒト多能性幹細胞の祖先からアストロスフィアを生成する方法を示しています。これには、成長因子とキナーゼ阻害剤を含む栄養培地による幹細胞の成長と増殖が含まれます。その後、これらの細胞は凝集してアストロサイトに分化し、アストロスフィアを形成します。

Protocol

1. 細胞培養と試薬調製

1. 細胞培養用のコーティングプレートを調製します。
   1. 細胞外マトリックス(ECM)コーティング溶液をDMEM/F12培地で希釈し、1 mg/mLのストック溶液を調製します。希釈したECMストック溶液をそれぞれ3mLの30本の円錐形チューブに分注し、すぐに-20°Cで保存します。ワーキングソリューションとして、3 mLのECMストックを33 mLの予冷済みDMEM/F12培地に再懸濁し、総容量を36 mLにして80 μg/mLの濃度にします。
   2. 6ウェル細胞培養プレートのウェルあたり1 mLをECMワーキング溶液でコーティングします。ウェルあたりさらに1 mLのDMEM/F12を(必要な場合)追加して、ウェルの表面が完全に覆われていることを確認します。コーティングされた6ウェル細胞培養プレートを室温で少なくとも1時間放置してから使用してください.
      注:コーティングされたプレートは、インキュベーター内または4°Cで最大2週間保存できます。
2. 培地の処方、成長因子、および低分子を調製します。
   1. 500 mLのヒト多能性幹細胞(hPSC)培地を調製するには、メーカーの指示に従って20倍および500倍のサプリメントを添加します。
   2. 500 mLの神経培地(NM)を調製するには、最終濃度2 mg/mLにヘパリン、1xの抗生物質/抗真菌溶液、1x B27サプリメント、または1x N2サプリメントを、L-グルタミンサプリメントを含むDMEM/F12の500 mLボトルに加えます。
   3. Rhoキナーゼ阻害剤Y27632 (Y) の10 mM (1,000x) 原液を調製するには、3 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に10 mgの粉末を添加します。ろ過、滅菌、分注、-20°Cで保存し、培地中の10μMの作業濃度で使用します。
   4. 20 mM(10,000倍)のSB431542原液を調製するには、1.3 mLのジメチルスルホキシド(DMSO)に10 mgの粉末を加えます。DMH1の2 mM(1,000倍)原液を調製するには、13.1 mLのDMSOに10 mgの粉末を加えます。各溶液をろ過、滅菌、分注し、-20°Cで保存します。それぞれを培地(NM + SB431542 + DMH1)中の2 μMの使用濃度で使用します。
      手記： このプロトコルでは、SB431542とDMH1の両方の2μMの使用濃度を推奨しています。これは、この濃度がhPSCからの神経誘導を効果的に促進するという私たちの観察結果と他の人からの報告に基づいています。より高い濃度も報告されています30。さらに、代替メディアでは、高神経変換に低分子は必要ないことも示されています。したがって、使用濃度は代替の細胞培養環境によって異なり、最適な濃度は個々の研究者が試験する必要があります。
   5. 上皮成長因子(EGF)および線維芽細胞成長因子-2(FGF2)の100 μg/mL(10,000倍)ストック溶液を個別に調製するには、それぞれ1 mgを10 mLのPBS + 0.1% BSAに加えます。EGFおよびFGF2ストック溶液を50 μLのアリコートに分注し、-80°Cで保存します。それぞれを10 ng/mLの作業濃度で培地に使用してください。例えば、50 mLのNM(NM + EGF + FGF2)に5 μL EGFと5 μL FGF2を加えます。
   6. 塩酸ドキシサイクリン(Dox)の原液を調製するには、まず粉末をDMSOに溶解して100 mg / mLにし、-20°Cで保存します。さらに、それを希釈してPBS中の2 mg/mL(1,000x)ストック溶液を作り、-20°Cで保存します。例えば、50 mLのNM(NM + Dox)に50 μL Doxを添加します。
      手記： 解凍後は溶液を再凍結しないでください。

>2. ヒト人工多能性細胞(hPSC)からの神経サブタイプの生成

注:すべての細胞培養は、5%CO2を37°Cでインキュベーターに保持する必要があります。これらの培養物は室内の酸素レベルに維持されますが、より低いレベルを利用することもできます。

1. hPSCsからアストロサイト前駆細胞(hAstros)を作製・維持する
   手記： このセクションでは、簡潔で簡略化された差別化プロトコルについて説明します。詳細な説明(胚様体形成、ロゼット選択、および局所パターニングステップ)については、前述のプロトコル(図1A、点線の緑色のボックス)を参照してください。
   1. hPSCのシードクラスター(図1B)をECMコーティング6ウェルプレート(ステップ1.1を参照)に、ウェルあたり2 mLのhPSC培地+ Yで保存します。幹細胞が約50%コンフルエントになるまで毎日栄養を与え、必要に応じて分割します。
      1. hPSCを分割するには、1 mLの継代試薬をウェルに添加し、1分後に吸引します。細胞を室温で5分間インキュベートし、1 mLのhPSC培地を加え、凝集体を新しいECMコーティングウェルに1:10
      分割します。
   2. 幹細胞が約50%コンフルエントになるまで幹細胞を維持し、その後培地をNM + SB431542 + DMH1に変更して神経分化を誘導します(0日目)。細胞が約95%コンフルエントになったら、同じ培地で新しいECMコーティングウェルに1:6で分割します。
   3. 14日目に、細胞を剥離溶液で解離し、Yでコーティングされていないフラスコに移して凝集体の形成を促進します
      手記： Yの添加は、細胞の生存と球体形成を促進するために利用されますが、すべての給餌中に含まれるわけではありません。
   4. ニューロン前駆細胞およびニューロン(hNeurons)の生成には、以下に説明するようにこれらのday-14細胞を使用してください。あるいは、ニューロンの成熟が起こる前、または神経膠形成が始まる前に、単層または球培養からの後の時点でこれらの細胞を利用します
      手記： デフォルトでは、このプロトコルは背側皮質アストロサイトを産生します。しかし、アストロサイトのサブタイプは、必要に応じてパターニングモルフォゲンを添加することにより、地域的に特定することができる。レチノイン酸(RA)は、細胞を脊髄表現型に尾化するために添加することができますが、ソニックヘッジホッグ(SHH)、スムージングアゴニスト(SAG)、またはプルモルファミンは腹側表現型を生成します。
   5. 自発的に形成された3D凝集体(hAstrospheres)でアストロサイト前駆細胞とアストロサイトを生成するには、NM + EGF + FGF2に切り替えて、前に詳述したように毎週(または安定したpHを確保するために必要に応じて)給餌します。
      1. 暗い中心が現れたら、hAstro凝集体を剥離液で穏やかに解離し、自然に付着する球体を取り除きます。球体の健康を維持し、壊死したコアを避けるために、週に一度球体を静かに壊してください。
         手記： 剥離液による治療は5分を超えないようにしてください。.
      2. 増殖後4〜6か月後、細胞の同一性を確認し、凍結保存培地(製造元の指示に従って)または液体窒素での長期保存のための代替保存条件で凍結するか、すぐに実験に使用します。

Results

図 1: hPSCに由来する3D神経球の分化と形成の段階的な描写。(A)議定書の主要なステップのタイムライン。(B)ヒト人工多能性幹細胞(hPSC)から神経細胞の純粋な集団を作製できる。アストロサイト前駆細胞(緑色の点線のボックス)の生成については、ステップ2.1を参照してください。(C)ニューロゲニン2の誘導過剰発現を介してトランスジェニックhPSCから生成された誘導性ニューロン(iNeurons;セクション2.2を参照)は、2D ECM(7日目)でニューロンの形態を示し、MAP2に陽性です(挿入図)。(D)マイクロウェルプレートから除去された球体は、ハイスループットスクリーニングに対して一貫したサイズを示しています。球体は、融合を防ぐために必要に応じてスピナーフラスコバイオリアクターで培養することができます。スケールバー = 50 μm (C, 挿入図)。スケールバー = 200 μm (A...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
6ウェルプレート	フィッシャーサイエンティフィック	08-772-1B
15mlコニカルチューブ	オリンパスのプラスチック	28から101
アキュターゼ	シグマ	A6964-100ミリリットル	デタッチメントソリューション
AggreWellプレート	ステムセルテクノロジー	34850
付着防止リンスソリューション	ステムセルテクノロジー	7010	マイクロウェルプレートへの細胞接着を防止
アンチ/アンチ	サーモフィッシャー	15240062
B27	サーモフィッシャー	17504044	メディアサプリメント
BrainPhysニューロン媒体	ステムセルテクノロジー	5790	神経生理学的基礎培地の代替品
クライオスターCS10	ステムセルテクノロジー	7930	10% DMSOを含む凍結保存培地
DMEM/F12	サーモフィッシャー	〒10565-042	GlutaMAXサプリメント付き
DMH-1	ステムセルテクノロジー	73634	危険:飲み込むと有毒です。作業濃度:2 μM
ドキシサイクリン塩酸塩(Dox)	シグマ	D3072-1ミリリットル	ハザード:妊婦にとって有毒です。使用濃度:2 ug/mL
上皮成長因子(EGF)	ペプロテック	AF-100-15	使用濃度:10 ng/mL
線維芽細胞成長因子-2(FGF)	ペプロテック	100-18B	使用濃度:10 ng/mL
血球計算盤または自動セルカウンター	ライフテクノロジー	AMQAX1000
マトリゲル膜マトリックス	コーニング	354230	ECMコーティングソリューション。使用濃度:80 ug / ml。氷上で準備し、ピペット、チューブ、およびメディアが事前に冷やされていることを確認してください。
取り付けソリューション
N2	サーモフィッシャー	17502048	メディアサプリメント
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	ステムセルテクノロジー	CA008-300
リレSR	ステムセルテクノロジー	5872	剥離・継代試薬
Rhoキナーゼ阻害剤Y27632-(Y)	トクリス	1254	作業濃度:10 uM
SB431542	ステムセルテクノロジー	72234	作業濃度:2 μM
T25 カルチャーフラスコ	オリンパスのプラスチック	25〜207	通気キャップ
T75 カルチャーフラスコ	オリンパスのプラスチック	25〜209	通気キャップ