非トランスジェニックおよびトランスジェニックヒト多能性幹細胞の神経前駆細胞への分化

要約

出典:Cvetkovic, C., et al. Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (2018).

このビデオは、非トランスジェニックおよびトランスジェニックヒト多能性幹細胞(hPSC)から神経前駆細胞を生成する方法を示しています。hPSCは、ニューロン分化培地を使用して神経前駆細胞に分化されます。非トランスジェニック細胞では低分子を用いて分化が誘導されますが、トランスジェニックhPSCは、ニューロン分化特異的な転写因子のプロモーターを誘導する抗生物質を添加することで分化します。

プロトコル

実験を行う際に倫理的な承認が得られました。

1. 細胞培養と試薬調製

1. 細胞培養用のコーティングプレートを調製します。
   1. 細胞外マトリックス(ECM)コーティング溶液をダルベッコのModified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12(DMEM/F12)培地で希釈し、1 mg/mLのストック溶液を調製します。希釈したECMストック溶液をそれぞれ3mLの30本の円錐形チューブに分注し、すぐに-20°Cで保存します。ワーキングソリューションとして、3 mLのECMストックを33 mLの予冷済みDMEM/F12培地に再懸濁し、総容量を36 mLにして80 μg/mLの濃度にします。
   2. 6ウェル細胞培養プレートのウェルあたり1 mLをECMワーキング溶液でコーティングします。ウェルあたりさらに1 mLのDMEM/F12を(必要な場合)追加して、ウェルの表面が完全に覆われていることを確認します。コーティングされた6ウェル細胞培養プレートを室温で少なくとも1時間放置してから使用してください.
      手記：コーティングされたプレートは、インキュベーター内または4°Cで最大2週間保存できます。
2. 培地の処方、成長因子、および低分子を調製します。
   1. 500 mLのヒト多能性幹細胞(hPSC)培地を調製するには、メーカーの指示に従って20倍および500倍のサプリメントを添加します。
   2. 500 mLの神経培地(NM)を調製するには、最終濃度2 mg/mLにヘパリン、1xの抗生物質/抗真菌溶液、1x B27サプリメント、または1x N2サプリメントを、L-グルタミンサプリメントを含むDMEM/F12の500 mLボトルに加えます。
   3. Rho-Kinase Inhibitor Y27632 (Y) の 10 mM (1,000x) 原液を調製するには、3 mL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) に 10 mg の粉末を添加します。フィルター滅菌、分注、-20°Cで保存し、培地中の10μMの作業濃度で使用します。
   4. 20 mM(10,000倍)のSB431542原液を調製するには、1.3 mLのジメチルスルホキシド(DMSO)に10 mgの粉末を加えます。DMH1(4-[6-(4-イソプロポキシフェニル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-3-イル]キノリン、4-[6-[4-(1-メチルエトキシ)フェニル]ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-3-イル]-キノリン)の2 mM(1,000倍)原液を調製するには、10 mgの粉末を13.1 mLのDMSOに加えます。各溶液をフィルター滅菌、分注、-20°Cで保存し、培地中の2μMの使用濃度でそれぞれを使用します(NM + SB431542 + DMH1).
      手記：このプロトコルでは、SB431542とDMH1の両方の2 μMの使用濃度を推奨しています。これは、この濃度がhPSCからの神経誘導を効果的に促進するという私たちの観察と他の人からの報告に基づいています。より高い濃度も報告されています。さらに、代替メディアでは、高神経変換に低分子は必要ないことも示されています。したがって、使用濃度は代替の細胞培養環境によって異なり、最適な濃度は個々の研究者が試験する必要があります。
   5. 塩酸ドキシサイクリン(Dox)の原液を調製するには、まず粉末をDMSOに溶解して100 mg / mLにし、-20°Cで保存します。さらに希釈してPBS中の2 mg/mL(1,000x)原液を調製し、-20°Cで保存します。培地中の2 μg/mLの使用濃度で使用します。例えば、50 mLのNM(NM + Dox)に50 μL Doxを加えます。
      手記：解凍後は溶液を再凍結しないでください。

>2. ヒト人工多能性細胞(hPSC)からの神経サブタイプの生成

>注:すべての細胞培養物は、5%_CO2のインキュベーターで37°Cで維持する必要があります。これらの培養物は室内の酸素レベルに維持されますが、より低いレベルを利用することもできます。

1. hPSCからアストロサイト前駆細胞(hAstros)を作製し、維持します。
   手記：このセクションでは、簡潔で簡略化された差別化プロトコルについて説明します。(図1A、緑色の点線のボックス)。
   1. hPSCのシードクラスター(図1B)をECMコーティング6ウェルプレート上に、ウェルあたり2 mLのhPSC培地+ Yを入れます。幹細胞が約50%コンフルエントになるまで毎日栄養を与え、必要に応じて分割します。
      1. hPSCを分割するには、1 mLの継代試薬をウェルに添加し、1分後に吸引します。細胞を室温で5分間インキュベートし、1 mLのhPSC培地を加え、凝集体を新しいECMコーティングウェルに1:10
      分割します。
   2. 幹細胞が約50%コンフルエントになるまで幹細胞を維持し、その後培地をNM + SB431542 + DMH1に変更して神経分化を誘導します(0日目)。細胞が約95%コンフルエントになったら、同じ培地で新しいECMコーティングウェルに1:6で分割します。
   3. 14日目に、細胞を剥離溶液で解離し、Yでコーティングされていないフラスコに移して凝集体の形成を促進します
      手記：Yの添加は、細胞の生存と球体形成を促進するために利用されますが、すべての給餌中に含まれるわけではありません。
   4. ニューロン前駆細胞およびニューロン(hNeurons)の生成には、トランスジェニック細胞について説明したように、これらのday-14細胞を使用して分化します。
2. hPSCから誘導性ニューロン(iNeurons)を生成・維持します。​
   1. ECMコーティングされた6ウェルプレート上にトランスジェニックhPSC(安定したドキシサイクリン誘導性ニューロゲニン2導入遺伝子を含む)を、ウェルあたり2 mLのhPSC培地+ Yで播種します(上記の非トランスジェニック系統の場合)。ウェルあたり2 mLの培地を毎日給餌し、70%の密度で持ち上げる準備が整います。上記のようにセルを分割します。
   2. 細胞が約35%コンフルエントになったら、NM+Doxを添加してiNeuronsへの分化を誘導します
      手記：細胞はニューロン前駆細胞に移行しますが、神経突起はまだ伸びません。

結果

図1:hPSCに由来する3D神経球の分化と形成の段階的な描写(A)プロトコルの主要なステップのタイムライン。(B)ヒト人工多能性幹細胞(hPSC)から神経細胞の純粋な集団を作製できる。(C)ニューロゲニン2の過剰発現を誘発することによりトランスジェニックhPSCから生成された誘導性ニューロン(iNeurons;セクション2.2を参照)は、2D ECM(7日目)でニューロンの形態を示し、MAP2に対して陽性である(挿入図)。 (D)マイクロウェルプレートから除去された球体は、ハイスループットスクリーニングに対して一貫したサイズを示す。球体は、融合を防ぐために必要に応じてスピナーフラスコバイオリアクターで培養することができます。スケールバー = 50 μm (C, ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
6ウェルプレート	フィッシャーサイエンティフィック	08-772-1B
15 mLコニカルチューブ	オリンパスのプラスチック	28から101
アキュターゼ	シグマ	A6964-100ミリリットル	デタッチメントソリューション
B27	サーモフィッシャー	17504044	メディアサプリメント
BrainPhysニューロン媒体	ステムセルテクノロジー	5790	神経生理学的基礎培地の代替品
DMEM/F12	サーモフィッシャー	〒10565-042	GlutaMAXサプリメント付き
DMH-1	ステムセルテクノロジー	73634	危険:飲み込むと有毒です。使用濃度:2 μM
ドキシサイクリン塩酸塩(Dox)	シグマ	D3072-1ミリリットル	ハザード:妊婦にとって有毒です。使用濃度:2 μg/mL
血球計算盤または自動セルカウンター	ライフテクノロジー	AMQAX1000
ヘパリン	シグマ	H3149-50KUさん	使用濃度:2 mg/mL
マトリゲル膜マトリックス	コーニング	354230	ECMコーティングソリューション。使用濃度:80μg/ml。氷上で準備し、ピペット、チューブ、およびメディアが事前に冷やされていることを確認してください。
N2	サーモフィッシャー	17502048	メディアサプリメント
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	ステムセルテクノロジー	CA008-300
ポリ-l-オルニチン(PLO)	シグマ	P3655-100MG	使用濃度:0.5 mg/mL
リレSR	ステムセルテクノロジー	5872	剥離・継代試薬
Rhoキナーゼ阻害剤Y27632-(Y)	トクリス	1254	作業濃度:10 uM
SB431542	ステムセルテクノロジー	72234	使用濃度:2 μM
T25 カルチャーフラスコ	オリンパスのプラスチック	25〜207	通気キャップ
T75 カルチャーフラスコ	オリンパスのプラスチック	25〜209	通気キャップ
TeSR-E8 基礎培地	ステムセルテクノロジー	5940	ヒト多能性幹細胞(hPSC)培地
TeSR-E8サプリメント	ステムセルテクノロジー	5940	ヒト多能性幹細胞培地用サプリメント
トリパンブルー	インビトゲン	T10282