アストロサイトとニューロンの3D共培養球を生成してシナプス形成を誘導

要約

出典:Cvetkovic, C., et al.ヒト多能性幹細胞からのアストロサイトとニューロンの3D共培養によるシナプス微小回路モデリング。J. Vis. Exp.(2018年)。

このビデオでは、アストロサイトとニューロンを共培養して3D球を形成する手順を示しています。これらの3D球体は、シナプス形成とニューラルネットワーク統合を調べるための明確なプラットフォームを提供し、それによって発達神経科学、神経変性疾患、および神経薬理学的介入の研究の潜在的なモデルとして機能します。

プロトコル

1. 3Dスフィア共培養の準備と保守

1. 懸濁液中の3D凝集体からhAstrosを解離します。​
   1. 暗い中心が現れたら、ヒトアストロサイト(hAstro)凝集体を剥離液で穏やかに解離し、自発的に付着する球体を取り除きます。球体の健康を維持し、壊死したコアを避けるために、週に一度球体を静かに壊してください。
      注:剥離液による治療は5分を超えないようにしてください。
2. hNeuronsまたはiNeuronsを2D単分子膜から解離します。
   1. 6ウェルプレートから培地を取り出し、hNeuron(ヒトニューロン)またはiNeurons(誘導性ニューロン)の各ウェル含有単層培養物に500μLの剥離溶液を加えます。37°Cで5分間インキュベートします。2-3 mLのDMEM/F12基礎培地を穏やかに加え、付着した細胞を除去します。
   2. 細胞と培地を15 mLのコニカルチューブに集め、300 x gで1分間遠心分離します。上清を吸引し、1 mLの新鮮な培地を加え、1,000 μLのマイクロピペットで静かに上下にピペットで動かして、シングルセル懸濁液を作成します。
3. マイクロウェル培養プレートを使用して3D球体を形成します。
   1. マイクロウェルプレートの各ウェルに0.5 mLの付着防止リンス液を加えてプレートを調製します。2,000 x gで5分間遠心分離プレート。すすぎ液を吸引し、各ウェルに1 mLのDMEM/F12基礎培地を加えて洗浄し、再度吸引します
      手記：使用中は、遠心分離機のバランスが取れていることを常に確認してください。
   2. 血球計算盤または自動セルカウンターを使用して、各細胞タイプをカウントします。解離したhAstrosとhNeuronsまたはiNeuronsの所望の比率を、総量2 mLの神経培地(NM)+ Y(iNeuronsが利用される場合はDoxを含む)の各ウェルに加えます。100 x gで3分間遠心分離プレートを調製し、インキュベーターに戻します.
      注:24ウェルマイクロウェルプレート(材料表を参照)には、ウェルあたり300個のマイクロウェルが含まれています。ウェルあたり2 mLの培地に、最小6 x 10⁵細胞(各2 x 10³細胞の球体の場合)および最大6 x 10⁶細胞(各2 x 10⁴細胞の球体の場合)を1ウェルあたり2 mLの培地に添加します。この範囲内の特定の密度の生存可能な球体の場合、定義された量のセルを使用し、300で割って球体あたりのセル数を計算します。必要に応じて、代替の球体形成方法およびツールも利用することができる。セル密度の許容範囲については、製造元の指示に従ってください。
   3. 次の2日間で、細胞がマイクロウェルプレート内で密集した球体に自己組織化します(図1A)。培養物が黄変している場合は、培地の50%を交換してください。
      手記：球体を乱さないように、メディアを取り外したり追加したりするときは、メディアの半分だけを交換し、ピペットで軽く交換してください。球体はマイクロウェルから浮き上がり、より高い力で融合することがあります。
   4. 2日後、1,000 μLのマイクロピペットでマイクロウェルから球体を静かに取り出します(図2D)。マイクロウェルの底に媒体で軽く力を加え、追加の付着した球体を取り除きます。球体を15mLの円錐管に沈殿させ、古い培地を吸引し、新しい培地を追加します。
4. 3D球を形成するためのスピナーフラスコバイオリアクターシステムを設定します。​
   1. マグネティックスタープレートの表面を70%エタノールで洗浄し、細胞培養インキュベーターに入れます。オートクレーブの個々のスピナーフラスコを滅菌します。
   2. 各スピナーフラスコに最低50〜60 mLの培地を含む球体を追加します(図2D、挿入図)。フラスコを60rpmにセットしたマグネチックスタープレートに置きます。データ収集の準備ができるまでスピナーフラスコで培養球.
      手記：シナプス形成には、最低3週間の培養が必要です。

結果

図1:バイオエンジニアリングされた3D神経球の系統的で再現性のある生成。 (A)マイクロウェル(μウェル)培養プレートを使用して、所望の密度およびニューロン対アストロサイトの比率の3D神経球を系統的かつユーザー指定の方法で形成し、一貫したサイズと形状を実現します。画像は球体形成の1日後を示しています。スケールバー = 200 μm. (B) 開始細胞密度の範囲(マイクロウェルあたり4 x 10³から2 x 10⁴細胞まで)は、さまざまなサイズの球体を生成します。マイクロウェルプレートがない場合、hPSCは結合して、直径が1週間後に拡散限界を超える非常に大きく不均一な凝集体を形成します(n = グループおよび時点あたり6〜14球)。(C...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
6ウェルプレート	フィッシャーサイエンティフィック	08-772-1B
15mlコニカルチューブ	オリンパスのプラスチック	28から101
アキュターゼ	シグマ	A6964-100ミリリットル	デタッチメントソリューション
AggreWellプレート	ステムセルテクノロジー	34850
付着防止リンスソリューション	ステムセルテクノロジー	7010	マイクロウェルプレートへの細胞接着を防止
アンチ/アンチ	サーモフィッシャー	15240062
B27	サーモフィッシャー	17504044	メディアサプリメント
BrainPhysニューロン媒体	ステムセルテクノロジー	5790	神経生理学的基礎培地の代替品
DMEM/F12	サーモフィッシャー	〒10565-042	GlutaMAXサプリメント付き
DMH-1	ステムセルテクノロジー	73634	危険:飲み込むと有毒です。作業濃度:2 μM
ロバの美容液	ランパイア生物学研究所	7332100	使用濃度:一次ブロッキングバッファーで5%、二次ブロッキングバッファーで1%
ドキシサイクリン塩酸塩(Dox)	シグマ	D3072-1ミリリットル	ハザード:妊婦にとって有毒です。使用濃度:2 ug/mL
上皮成長因子(EGF)	ペプロテック	AF-100-15	使用濃度:10 ng/mL
線維芽細胞成長因子-2(FGF)	ペプロテック	100-18B	使用濃度:10 ng/mL
血球計算盤または自動セルカウンター	ライフテクノロジー	AMQAX1000
マトリゲル膜マトリックス	コーニング	354230	ECMコーティングソリューション。使用濃度:80 ug / ml。氷上で準備し、ピペット、チューブ、およびメディアが事前に冷やされていることを確認してください。
MEA 2100システム	マルチチャネルシステム	MEA2100
Rhoキナーゼ阻害剤Y27632-(Y)	トクリス	1254	作業濃度:10 uM
SB431542	ステムセルテクノロジー	72234	作業濃度:2 μM
スピナーフラスコ	フィッシャーサイエンティフィック	4500〜125
T25 カルチャーフラスコ	オリンパスのプラスチック	25〜207	通気キャップ
トリパンブルー	インビトゲン	T10282

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