骨髄間質細胞からのシュワン細胞様細胞の生成

要約

出典:Tsui, Y., et al. 成熟シュワン細胞の生成のためのソースとしての骨髄由来前駆細胞の低酸素プレコンディショニング。J. Vis. Exp. (2017年)

このビデオは、多能性骨髄間質細胞(BMSC)からシュワン細胞様細胞を得る方法を示しています。最初に、BMSCは低酸素治療を受け、続いてニューロン前駆細胞への指向性分化が行われます。続いて、特定の培地および培養条件を用いて、これらの前駆細胞のシュワン細胞様細胞への形質転換を誘導する。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. ラットMSC培養物の調製

1. 大腿骨からのMSCの収穫
   1. すべての解剖ツール(すなわち、微細解剖ハサミ、先端が鈍い切断ハサミ、歯付き鉗子)を180°Cで少なくとも2時間オートクレーブしてから使用してください。
   2. 15% ウシ胎児血清 (FBS) とペニシリン/ストレプトマイシン (P/S、1% v/v) を添加した最小限の必須培地 - α 修飾 (αMEM) からなる MSC 増殖培地を調製します。
   3. ペントバルビトンの過剰摂取(240 mg / kg体重、腹腔内)による若いオスのSprague Dawleyラット(体重200-250 g)を犠牲にします。.
      手記：異なるラットの骨髄サンプルは別々に処理する必要があります。
   4. 犠牲にされた動物を仰臥位に置きます。腹部と下肢を70%エタノールで徹底的に洗浄します。
   5. 細かい解剖ハサミと鉗子を使用して、太ももの内側の皮膚と皮下組織を取り除きます。大腿骨が露出するまで、大腿部の筋肉を円周方向に取り除きます。膝と股関節が見えるまで、これを近位および遠位に続けます。先端が鈍い切断はさみを使用して、股関節と膝関節を介して大腿骨を解剖します.
      手記：この段階では、大腿骨を切除して骨髄腔を露出させないでください。無傷の大腿骨を層流組織培養フードに移し、さらなる処理を行います。
   6. 先端が鈍い切断はさみを使用して、骨幹端を介して大腿骨の遠位端と近位端を横断します。
   7. 70 μmのセルストレーナーを50 mLのコニカルチューブの上に置きます。リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS、10 mM Na₂HPO₄、pH 7.4)を含む21 G、10 mLシリンジを露出した大腿管に挿入し、フラッシュを繰り返して骨髄内容物を円錐管に洗い流します。
      手記：各大腿骨を洗い流すために、約20mLのPBSを使用します。洗い流された内容物の色が血まみれで濁ったままの場合は、より多くの量を使用できます。
   8. 480 x gで5分間遠心分離して細胞を回収し、上清を捨てます。細胞ペレットを10 mLのMSC増殖培地に再懸濁します。細胞を10cmの組織培養皿に播種します。組織培養皿を細胞インキュベーター(37°C、5%CO₂)に入れます。めっきの初日を 0.
      日として記録します。 手記：遠心分離を含むすべてのステップで、ブレーキを最大減速するように設定してください。
2. MSCコロニーの設立と拡大
   手記： このプロトコルは、骨髄腔内からMSCを選択するための組織培養プラスチック接着に依存しています。骨髄内容物を組織培養プラスチックに2日間付着させる。
   1. 2日目に、培養プレートを10mLのPBSで3回すすぎ、非接着性細胞を除去します。すすぎ後、PBSを10 mLのMSC増殖培地と交換します。細胞をPBSで洗浄し、3日ごとにMSC増殖培地を補充します
      手記：MSCコロニーは6〜7日目までに見えるはずです(図1A)。
   2. 増殖培地を取り出し、PBSで細胞をすすぐことにより、10日目までに細胞を継代します。1.5 mLの組換え酵素細胞解離試薬を添加し、37°Cで5分間インキュベートします。MSC増殖培地3mLを添加して反応を中和します。分離した細胞を250 x gで5分間遠心分離して回収します。
   3. PBSで適切に希釈した後、血球計算盤を使用してペレット内の細胞を定量します。
   4. 40,000細胞/cm²の密度で細胞をMSC増殖培地中の10cm培養プレートに播種します><。 手記：ラットMSCは、継代後2日以内に80〜90%のコンフルエンスに達するはずです(図1B)。細胞は、ステップ1.2.2で説明したように、最大8つの継代について継代することができる。MSCは、免疫細胞化学と三系統分化の能力を用いて特徴付けることができます(図2)。継代3と8の間のMSC培養のみが、その後の低酸素プレコンディショニングおよび神経前駆細胞の濃縮の対象となります。継代数が多いMSCは、扁平な形態を採用し(図1C)、十分な神経前駆細胞を産生しません。これらのカルチャは破棄されるべきです。

2. ヒトBMSC培養物の準備

1. 1 mLのヒト骨髄穿刺液を9 mLのMSC増殖培地で希釈し、10 cmの組織培養皿に細胞をプレート化します。培養物を細胞インキュベーター(37°C、5%CO₂)で保存します。
2. 2日後に培地を取り出し、10 mLのPBSで培養物を3回穏やかにすすぎ、非接着性細胞を除去します。最終すすぎ後、PBSを取り出し、10 mLのMSC増殖培地と交換します。PBSリンス後、3日ごとに培養後に増殖培地を補充します.
   手記：MSCコロニーは6〜7日目までに見えるはずです。コロニーの数は被験者によって異なる場合があります。
3. ステップ1.2.2で説明したように、10日目に細胞を継代します。PBSで適切に希釈した後、血球計算盤を使用してペレット内の細胞を定量します。継代した細胞を40,000細胞/cm²の密度でMSC増殖培地の10cm培養プレートに播種します
   手記：ヒトMSC(図1D)は、ラットMSCと同様の形態を示し、継代後2日以内に80〜90%のコンフルエンスに達するはずです。それらは、免疫細胞化学と三系統分化の能力を使用して特性評価する必要があります。ラットMSCと同様に、継代3と8の間のヒトMSCは、その後の低酸素プレコンディショニングおよび神経前駆細胞濃縮を受ける。

3. 低酸素プレコンディショニング

1. リングクランプを解放した後、低酸素チャンバーコンポーネント(つまり、ベース、蓋、トレイ)を分解し、個々の部品を70%エタノールで清掃します。チャンバー成分を層流組織培養フード内に置き、UV光下で15分間滅菌します。
2. 低酸素プレコンディショニングの前に、培地を取り出し、ラットとヒトのMSC培養物(セクション1および2)を10mLのPBSですすいでください。PBSを、25 mM HEPESを添加した10 mLのMSC増殖培地と交換します
   手記：10cmの皿で培養したMSCは、低酸素プレコンディショニングを受ける前に80〜90%のコンフルエントに達しているはずです。
3. 培養皿を低酸素チャンバー内に置きます。チャンバーコンポーネントを再組み立てし、リングクランプを締めます。99% N₂/1% O₂ の混合ガスを 10 L/min の流量で 5 分間チャンバーに流します。
4. 低酸素チャンバーの接続端をシールして、ガス漏れがないようにします。チャンバーを細胞インキュベーター(37°C、5%CO₂)内に16時間置きます。
5. 低酸素プレコンディショニングが完了したら、その後の神経前駆細胞濃縮培養の準備として、培養物をチャンバーから取り出します。

4. 神経前駆細胞濃縮培養

1. ダルベッコの改変ワシ培地/ハムの栄養混合物F12(DMEM/F12)にB27(2%v / v)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF、20 ng / mL)、上皮成長因子(EGF、20 ng / mL)、およびP / S(1%v / v)を補給した神経前駆細胞培地を調製します。
2. ステップ1.2.2で説明されているように、低酸素プレコンディショニングラット/ヒトMSCを切り離します。分離した細胞を250 x gで5分間遠心分離して回収します。PBSで適切に希釈した後、血球計算盤を使用してペレット内の細胞を定量します。
3. 神経前駆細胞培地に細胞を再懸濁し、6,000細胞/cm²の密度で低接着の6ウェルプレートに播種します。培養物を細胞インキュベーター(37°C、5%CO₂)に12日間置きます。神経前駆細胞培地の75%を3日ごとに補充します.
   手記：かなりの非接着性細胞クラスターは、6〜7日目までに観察する必要があります。10〜12日目までに、直径≥100μmのニューロスフェアを観察できます(図3)。低酸素プレコンディショニングMSCは、正常酸素条件下で培養されたMSCよりも多くのニューロスフェアを産生するはずです。
4. 12日目にニューロスフェアを吸引して10mLピペットに吸い込み、15mLコニカルチューブに移して採取します。ニューロスフェアを250 x gで5分間遠心分離します.
   手記：ニューロスフェアは、ネスチンやGFAPなどの神経前駆細胞マーカーについて、12日目に特徴付けることができます。

>5. シュワン細胞様細胞の生成

1. αMEMにβ-ヘレグリン(100 ng/mL)、bFGF(10 ng/mL)、血小板由来増殖因子(PDGF-AA、5 ng/mL)、FBS(10%)、P/S(1% v/v)を添加したグリア誘導培地を調製します。
2. セクション4で調製したニューロスフェアをPDL/ラミニン被覆6ウェルプレートに、ウェルあたり1.5mLのグリア誘導培地に1.5mLのグリア誘導培地で5〜10球/^cm2の密度でプレート化します。細胞をPBS.
   ですすいだ後、2日ごとにグリア誘導培地を交換してください。 手記：播種されたニューロスフェアからの細胞は、2日目までに外側に移動することが見られます。7日目までに、遊走細胞は先細りの外観を持ち、シュワン細胞マーカーp75ニューロトロフィン受容体(p75)およびS100βに対して免疫陽性を示すはずです。これらの細胞はSCLCと呼ばれます。

結果

図1:MSCコロニーの設立。 かなりのMSCコロニーは、骨髄細胞を組織培養プラスチックに播種してから6〜7日後に見えるはずです。ラットMSCコロニーの代表的な画像が示されていますが(A)、ヒトのコロニーも同様の外観を示しています。コロニーは10日目に通過できます。より高い倍率で見ると、ラット(B)とヒト(D)の両方のMSCは、継代後に特徴的な線維芽細胞様の形態を示します。高い継代数で維持されたMSCは、平坦な四角形の形態(C)を獲得し、廃棄する必要があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
αMEM	シグマアルドリッチ	M4526
DMEM/F12	サーモフィッシャー科学	〒12400-024
FBSの	バイオセラ	FB-1280/500
B27	サーモフィッシャー科学	17504-001
上皮成長因子(EGF)	サーモフィッシャー科学	PHG0313
塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)	ペプロテック	100-18B/100UG
血小板由来成長因子-AA(PDGF-AA)	ペプロテック	100-13A
ヘレグリンβ-3、EGFドメイン(β-Her)	ミリポア	01-201
ポリ-D-リジン(PDL)	シグマアルドリッチ	P7886-1G型
ラミニン	サーモフィッシャー科学	23017015
ペニシリン/ストレプトマイシン(P / S)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15140-122
TrypLEエクスプレス	サーモフィッシャーサイエンティフィック	〒12604-013
接着培養用10cmプレート	TPPとは	93100	MSCの選定に使用
接着培養用の6ウェルプレート	TPPとは	92006	継代後のMSCの増設に使用
非接着培養用のUltraLow 6ウェルプレート	コーニング	3471	神経前駆細胞の濃縮に使用
対ヒトCD90(Thy-1)	BDバイオサイエンス	555593
対ヒトCD73	BDバイオサイエンス	550256
反ヒト/ネズミ STRO-1	R&Dシステム	MAB1038
抗ヒトCD45	BDバイオサイエンス	555480
低酸素チャンバー	ビラップス・ローテンバーグ	MIC-101
HEPESバッファー	シグマアルドリッチ	H4034-100G(英語版)
反人間ネスティン	R&Dシステム	MAB1259
抗ラットCD90(Thy-1)	BDバイオサイエンス	554895
抗ラットCD73	BDバイオサイエンス	551123
抗ラットネスチン	BDバイオサイエンス	MAB1259
抗ラットCD45	BDバイオサイエンス	554875
抗S100β	ダコ	Z031101
アンチp75	ミリポア	MAB5386
アンチGFAP	シグマアルドリッチ	G3893
抗クラスIII-βチューブリン(Tuj-1)	コーヴァンス	MMS-435Pの
反人間核	ミリポア	MAB1281

さん 年 名 の