DRGニューロンの単離とシュワン細胞前駆体との共培養によるシュワン細胞の生成

要約

出典:Tsui, Y, et al. 成熟シュワン細胞の生成源としての骨髄由来前駆細胞の低酸素プレコンディショニング. J. Vis. Exp. (2017).

このビデオは、ラットの胚から後根神経節(DRG)ニューロンを分離し、それらをシュワン細胞前駆体と共培養して成熟したシュワン細胞を生成する手順を示しています。単離されたDRGは、ニューロンとグリア細胞を単離するために処理されます。単離された細胞を培養してニューロンを精製し、ニューロンを共培養培地でシュワン細胞様細胞(SCLC)と共培養します。DRGニューロンとの相互作用は、SCLCのシュワン細胞への成熟につながります。

プロトコル

DRGニューロンとの共培養による運命コミットシュワン細胞の生成

1. 精製ラットDRGニューロンの調製

1. すべての解剖ツール(すなわち、解剖ハサミ、鉗子、2つの顕微解剖鉗子、および顕微解剖ハサミ)を180°Cで少なくとも2時間オートクレーブ
で加熱してください。
2. 6ウェル組織培養プレートにポリ-D-リジン(PDL、PBS中10 μg/mL)を4°Cで一晩コーティングします。PDLを取り外し、ウェルあたり1.5 mのPBSですすいでください。
3. プレートをラミニン(PBSで10 μg/mL)で37°Cで2時間コーティングし、ウェルあたり1.5 mLのPBSでプレートをすすぎます。
4. B27 (2% v/v)、L-グルタミン (1% v/v)、神経成長因子 (NGF、20 ng/mL)、およびペニシリン/ストレプトマイシン (P/S、1% v/v) を添加した神経基礎培地で構成される DRG ニューロン維持培地を調製します。
5. B27(2%v / v)、L-グルタミン(1%)、神経成長因子(NGF、20 ng / ml)、p / s(1%)、フルオロデオキシウリジン(FDU、10 μg / mL)、およびウリジン(10 μg / mL)を添加した神経基礎培地で構成されるDRGニューロン精製培地を調製します。
6. 妊娠 14-15 日目に妊娠中のラットをペントバルビタールの過剰摂取 (240 mg/kg 体重、腹腔内) で犠牲にします。
7. 犠牲にされた動物を仰臥位に置きます。70%エタノールで腹部を徹底的に洗浄します。
8. 細かい解剖はさみと鉗子を使用して、動物の下腹部壁を縦方向に切ります。解剖ハサミを使用して子宮を特定し、摘出します。子宮壁を切って胚を露出させ、摘出します。PBSで満たされた無菌の10cm培養皿に胚を移します。培養皿を氷の上に置きます。
9. 解剖する胚をPBS(室温)で満たされた無菌の10cm培養皿に移し、解剖顕微鏡の下に置きます。胚を腹臥位にします.
   手記：白っぽい脊髄と付着したDRGは、半透明の皮膚を通じて、胚の背側に見ることができます。
10. 脊髄の両側に沿ってマイクロダイセングスメント鉗子を挿入し、鈍的解剖を使用して、周囲の軟部組織から脊髄を分離し始めます。首の開口部と尾の切株に沿ってマイクロ解剖鉗子を使用して、脊髄を動物から解放します。臍帯の腹側に対してさらに鈍的解剖を行い、周囲の軟部組織から臍帯を解放します。
11. マイクロダイセプス鉗子を使用して、解放された脊髄の背側に残っている軟部組織を除去します.
    手記：この段階では、脊髄、神経根、および付着したDRGのみが残るはずです。
12. マイクロ解剖鉗子を使用して、個々のDRGを接続神経根から切り離します。1 mLチップに取り付けられたピペットペンを使用して、DRGをPBS.
    を含む1.5 mLの滅菌遠心チューブに移します。 手記：1.5mLチューブ1本につき、最大100個のDRGを収容できます。
13. DRGを250 x gで5分間遠心分離し、組換え酵素細胞解離試薬(チューブあたり200 μL)に再懸濁します。(37°C、5%CO₂)を10分間インキュベートします。DRGを250 x gで5分間遠心分離し、上清を除去し、DRGニューロン維持培地に再懸濁します。200 μLのピペットチップを使用して穏やかにトリチュレーションすることにより、ペレットを解離します。適切な希釈後、血球計算盤を使用してペレット内の細胞を定量します。
14. ウェルあたり1.5 mLのDRGニューロン維持培地中のPDL/ラミニン被覆6ウェルプレートに、5,000細胞/cm²の密度で細胞を播種します。2日間の培養後、DRGニューロン維持培地を取り出し、PBSですすぎ、DRGニューロン精製培地と交換します
    手記：各精製サイクルについて、DRG培養物を精製培地で2日間処理し、続いて維持培地で1日間インキュベートします。3〜4回の精製サイクルの後、すべての内因性グリアの除去が期待されます。これには約 14 日かかります。精製した培養物は、ニューロンマーカーTUJ1に対して陽性であり、S100βの発現は認められません(図1)。

2. シュワン細胞様細胞の生成

1. αMEM(Minimum essential medium Eagle (MEM), alpha modifications)にβ-ヘレグリン(100 ng/mL)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF, 10 ng/ml)、血小板由来成長因子(PDGF-AA, 5 ng/mL)、ウシ胎児血清(FBS, 10%)、およびP/S(1% v/v)を添加したグリア誘導培地を調製します。
2. セクション4で調製したニューロスフェアをPDL/ラミニン被覆6ウェルプレートに、ウェルあたり1.5mLのグリア誘導培地に1.5mLのグリア誘導培地でcm2あたり5〜10球の密度でプレートします。細胞をPBSですすいだ後、2日ごとにグリア誘導培地を交換してください。
3. 注:播種されたニューロスフェアからの細胞は、2日目までに外側に移動することが見られます。7日目までに、遊走細胞は先細りの外観を持ち、シュワン細胞マーカーp75ニューロトロフィン受容体(p75)およびS100β7に対して免疫陽性を示すはずです。これらの細胞はSCLCと呼ばれます。

3. SCLCとDRGニューロンの共培養

1. DRGニューロン維持培地(ステップ1.1.4)とグリア誘導培地(ステップ1.2.1)からなる共培養培地を、体積対体積比1:1で調製します。
2. ダルベッコの改変イーグル培地/栄養混合物F-12(DMEM/F12)にFBS(5%)、β-ヘレグリン(10 ng/mL)、およびP/S(1%v/v)を添加したシュワン細胞維持培地を調製します。
3. 7日目のSCLCから培地を取り出し、PBSですすぎ、0.5 mL/ウェルの組換え酵素細胞解離試薬と37°Cで5分間インキュベー
トします。
4. 適切な希釈後、血球計算盤を使用して細胞を定量します。
5. SCLCを精製したDRGニューロン培養物に1,000細胞/cm²の密度で播種します。共培養を14日間維持し、2日ごとに培地を交換します.
   手記：共培養中、SCLCは成熟シュワン細胞に典型的な紡錘体様の形態を獲得しました(図2)。これらの細胞は、成長因子の回収後も表現型を維持し、in vitroおよびin vivoで軸索を骨髄化することができます。シュワン細胞マーカー(すなわち、p75およびS100β)の陽性性は、免疫蛍光法によってモニターする必要があります。
6. 共培養が完了すると、継代運命はシュワン細胞をコミットしました。1ウェルあたり0.5 mLの解離試薬を使用してください。適切な希釈後、血球計算盤を使用して細胞を定量します。

結果

図 1:精製ラットDRGネットワークの確立。精製されたDRGネットワークは、抗有糸分裂薬FDUおよびウリジン(A)によるパルス処理後に確立されます。S100βを発現する内因性グリアを欠く神経突起ネットワーク(B)は、SCLCとの共培養の準備ができています。

図2:DRGニューロンとの共培養による骨髄由来シュワン細胞の生成。精製されたDRGニューロンおよびヒトSCLCとの2週間の共培養が完了すると、紡錘形の運命コミットシュワン細胞が、...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
αMEM	シグマアルドリッチ	M4526
DMEM/F12	サーモフィッシャー科学	〒12400-024
神経基礎媒体	サーモフィッシャー科学	21103-049
FBSの	バイオセラ	FB-1280/500
B27	サーモフィッシャー科学	17504-001
上皮成長因子(EGF)	サーモフィッシャー科学	PHG0313
塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)	ペプロテック	100-18B/100UG
神経成長因子(NGF)	ミリポア	NC011
血小板由来成長因子-AA(PDGF-AA)	ペプロテック	100-13A
ヘレグリンβ-3、EGFドメイン(β彼女)	ミリポア	01-201
ウリジン	シグマアルドリッチ	U3003
5-フルロ-2' - デオキシウリジン(FDU)	シグマアルドリッチ	F0503
ポリ-D-リジン(PDL)	シグマアルドリッチ	P7886-1G型
ラミニン	サーモフィッシャー科学	23017015
グルタマックス	サーモフィッシャー科学	35050061
ペニシリン/ストレプトマイシン(P / S)	サーモフィッシャー科学	15140-122
TrypLEエクスプレス	サーモフィッシャー科学	〒12604-013
接着培養用10cmプレート	TPPとは	93100	組織培養の付着によるMSCの選択に使用
接着培養用の6ウェルプレート	TPPとは	92006	継代後のMSCの増設に使用
非接着性培養用のUltraLow 6ウェルプレート	コーニング	3471	神経前駆細胞の濃縮に使用
低酸素チャンバー	ビラップス・ローテンバーグ	MIC-101
HEPESバッファー	シグマアルドリッチ	H4034-100G(英語版)

さん の 年 名