ハイドロゲルマイクロカラム内にアストロサイトスキャフォールドを作製するためのIn Vitro法

要約

出典:Katiyar, K. S., et al. Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration. J. Vis. Exp. (2018).

このビデオでは、ハイドロゲルマイクロカラム内に3次元のアストロサイトスキャフォールドを生成する方法を示します。マイクロカラムの内側はコラーゲンでコーティングされています。アストロサイトが導入され、コラーゲンに付着し、さらにインキュベーションすると、自己組織化して三次元の足場になります。

プロトコル

1. アガロースハイドロゲルマイクロカラムの開発

1. アガロース3 gを秤量し、100 mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)を含む滅菌ビーカーに移すことにより、アガロース3%重量/体積(w / v)溶液を作成します。ビーカーに滅菌磁気バーを追加し、ホットプレート/スターラーの表面に置きます。次のステップで内容物が蒸発するのを防ぐために、ビーカーを覆ったままにしておきます。
2. アガロースとDPBSを100°Cの温度で加熱し、60〜120rpmで攪拌します。必要に応じてこれらの設定を調整し、溶液が最初に不透明からアガロースが完全に溶解したことを示す明確な外観に変化するため、溶解プロセスの進行を常に監視します。
   注意： 熱いビーカーと溶液は熱いです!
3. アガロース溶液を加熱して攪拌しながら、空の10cmシャーレを4つ取り出し、そのうちの2つに20mLのDPBSを加えます。バイオセーフティキャビネット内に鍼(直径300μm、長さ40mm)、ガラスマイクロリットルの毛細管(直径701.04μm、長さ65mm、容量25.0μL)、バルブディスペンサーを入れます。液体アガロース溶液が澄んだら、約50°Cで一定の加熱を維持し、アガロースのゲル化を避けるために攪拌します。
4. バルブディスペンサーの底部の開口部に鍼をインクルージョンします。外側に露出した針の上に毛細管を挿入します。キャピラリーチューブの一部をバルブディスペンサーシリンダーのゴム部分に挿入して固定します。
5. マイクロピペットで1mLの液体アガロースを空のペトリ皿の表面に移し、キャピラリーチューブの一端をアガロースと接触させて垂直に(針を挿入した状態で)置き、バルブディスペンサーのゴムキャップを内側につまんでいます。バルブディスペンサーキャップの圧力をゆっくりと解放して、アガロースをキャピラリーチューブに引き込みます
   手記： 液体アガロースのキャピラリーチューブへの移動は、迅速に行う必要があります。液体アガロースをペトリ皿表面で十分な時間(約60秒)冷却すると、ゲル化し始め、キャピラリーチューブに沿ってアガロースが適切に吸引されなくなります。
6. 各球根チューブ針アセンブリをフリーシャーレに置き、毛細管内のアガロースゲルを5分間固化させます。
7. 鍼をゆっくりと毛細管から引き抜くことにより、手動で鍼を抜く;この手順では、新たに固化したアガロースシリンダーも、針を囲んだままチューブから滑り出します。滅菌鉗子の先端で鍼に沿ってマイクロカラムをそっと動かし、最後まで動かします。DPBSを含む開いたシャーレの上に針を置き、鉗子でマイクロカラムをDPBSに押し込みます.
   手記： 鍼を抜いてもアガロースマイクロカラムがガラス毛細管内に残っている場合は、25mmゲージの針でアガロースマイクロカラムを毛細管からゆっくりと押し出し、DPBSで皿に押し込みます。
8. マイクロメスまたは鉗子をホットビーズ滅菌器を使用して滅菌します。4 gのアガロースを秤量し、100 mLのDPBSに移すことにより、4% w / vアガロースを作製します。ステップ1.2で説明したように加熱して攪拌し、透明な4%液体アガロース溶液を得ます。次のステップ全体を通して、溶液の加熱と攪拌を維持します。
9. マイクロカラムの入ったシャーレを解剖フードに移し、細い鉗子の入ったマイクロカラムを空のシャーレに移します。ステレオスコープで視覚誘導を行い、マイクロメスでマイクロカラムを希望の長さにカットします。両端をトリミングして、水平から45^°の角度で斜めの端を形成し、細胞外マトリックス(ECM)および細胞添加中のマイクロカラムの取り扱いを容易にします。
10. 同じペトリ皿内のさらに3つのマイクロカラムについて前のステップを繰り返し、各シリンダー間に<3 mmの間隔を空けて4つのコンストラクトを平行に並べます。マイクロピペットで50μLの4%アガロース溶液をロードし、マイクロカラムアレイ上に液体のストリーク/ラインを注ぎ、コンストラクトを4つのグループ(以下「マイクロカラムボート」と呼びます)に接続して束ねます。内部を詰まらせる可能性のあるマイクロカラムの端への4%アガロースの移動を避けるには、コンストラクト間の距離を最小限に抑え、アガロースを細い線ですばやく追加します。
    手記：4つのマイクロカラムのグループを「ボート」に配置することは、アストロサイトスキャフォールドを作製するために必要ではありません。それにもかかわらず、ボートは製造プロセスを早め、後のステップでマイクロカラムをより安全に移動および取り扱う方法を提供するのに役立ちます。
11. マイクロカラムボートを1〜2分間冷まして、添加した4%アガロースのゲル化を可能にします。接続する4%アガロースによって細い鉗子が付いているmicro-column boatを拾い上げ、ステップ1.1.3で準備した他のDPBSを含むシャーレにマイクロコラムを移します。必要に応じて、残りのマイクロカラムでより多くのボートを作製します。
12. マイクロカラムやボートが入ったペトリ皿をバイオセーフティキャビネットに移し、紫外線(UV)に30分間さらして滅菌します
    注意： 紫外線への曝露を防ぐために、適切な保護具を着用してください。
13. マイクロカラムボートを搭載したディッシュは、ECM添加とセルプレーティングが直後に行われない場合は、最大1週間、DPBSで4°Cで保存します。この期間中にコンストラクトが使用されない場合は、マイクロカラムの作製手順を繰り返します。

2. 初代細胞の培養と単離

1. ラットの子犬からの皮質アストロサイトの分離
   1. 次の手順の準備として、解剖した組織のリザーバーとして機能する4つの10cmシャーレに20mLのハンク平衡塩溶液(HBSS)を追加します。すべての皿を氷の上に置いてください。清潔な手術用ハサミ、鉗子、マイクロスパチュラ、マイクロメスをホットビーズ滅菌器で滅菌します。
   2. 0.25% トリプシンを 1 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) および 0.15 mg/mL デオキシリボヌクレアーゼ I を HBSS 中で 37 °C で予温します。さらに、ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)とハムのF-12栄養混合物、および10%ウシ胎児血清(FBS)からなるアストロサイト培養培地を37°Cで予温します。
   3. 出生後0日目または1日目のSprague-Dawleyラットの子犬を低体温条件にさらして麻酔をかけ、斬首によって安楽死させます。目の前の鼻に配置された19mmゲージの針を使用して、頭をステージに固定します。
   4. メスで中央、後方から前方、首の付け根から目のすぐ後ろまで切開します。目の真後ろから横方向に別の切開を行い、T字型を形成します。細い鉗子を使用して、頭蓋骨/頭蓋骨を横に引き抜きます。
   5. 鉗子の一方の突起を動物の口に置き、もう一方の突起を外側の表面に置いて、頭を鼻で持ちます(上を向いています)。滅菌マイクロヘラで脳を取り出し、冷やしたHBSSで満たされたペトリ皿の1つに入れます。このペトリ皿は、使用時以外は常に、その直後に氷の上に置きます。
   6. 以前に-20°Cで保管されていた花崗岩のブロックを、解剖フード内のステレオスコープの下に置きます。解剖手順中に低温を維持するために、脳組織を花崗岩ブロックの表面に載せたペトリ皿を置きます。ステレオスコープは、次の手順全体で視覚的なガイダンスとして使用します。
   7. 嗅球が無傷のままの場合は、鉗子またはマイクロメスで切断して嗅球を抽出します。さらに、マイクロメスを使用して小脳を切除し、2つの大脳半球を分離する正中線切開を行います。鉗子で半球を新鮮で冷やしたHBSSが入ったシャーレに移します。
   8. 半球の内側から中脳の構造をマイクロメスで解剖し、分離した皮質のみを取得します。細い鉗子を使用して、シート状の構造である髄膜を皮質組織から剥がし、分離された皮質を冷たいHBSSを備えた新しいシャーレに移します。マイクロメスを使用して組織を細かく刻み、次のステップでトリプシン作用の表面積を増やします。
   9. パスツールピペットを使用して、4 mLの予熱済みトリプシン-EDTA(各チューブに8つの皮質)が入った15 mLの遠心分離チューブに皮質を移します。.皮質組織をトリプシン-EDTAに37°Cで5〜7分間さらします。
   10. パスツールピペットでトリプシン-EDTAを慎重に取り出し、400 μlの0.15 mg/mL DNAse I溶液を遠心チューブに加えます。すべての組織が解離し、液体中に組織片が残らなくなるまで、チューブまたはボルテックスを攪拌します。組織を完全に溶解できない場合は、パスツールピペットの先端で残りの断片を取り除きます。
   11. 解離した細胞溶液を含むチューブを200 x gで3分間遠心分離し、細胞を乱さずにパスツールピペットで上清を除去します。1 mLのアストロサイト培養培地(ステップ2.1.2で定義)をマイクロピペットでチューブに加え、撹拌して再懸濁し、均質な溶液を作成します。
   12. 血清学的ピペットで10 mLのアストロサイト培養培地をT-75フラスコに移します。1 mLの細胞溶液(ステップ2.1.11で調製)250 μlをマイクロピペットでフラスコに加え、フラスコ1本につき1匹の仔脳分に相当する細胞をプレートします。排出した細胞溶液を培地全体に均等に分配し、フラスコを穏やかに攪拌して、さらに均一な分布を促進します。
   13. メッキフラスコを加湿インキュベーターで37°C、5%CO₂で培養します。培養で24時間および72時間に達した後、フラスコを機械的に攪拌して、ニューロンやオリゴデンドロサイトなどの非接着性細胞タイプを分離します。
   14. その後、これらの各時点で、メディアの変更を実行します。フラスコを垂直に保持して、培地が付着した細胞を覆わないようにフラスコの底にくるようにします。パスツールピペットで培地を吸引し、ピペットの先端をフラスコの下部の角に押し付けて、細胞が抽出されないようにします。フラスコを元の水平位置に置き、血清学的ピペットで細胞上に10 mLのアストロサイト培地を静かに加えます。
   15. 各培地交換後にフラスコをインキュベーターに戻します。90%のコンフルエントが達成されたら、フラスコをもう一度機械的に攪拌して、残っている非接着細胞をすべて取り除きます。
   16. 真空とパスツールピペットで培地を取り出して、アストロサイトを通過させます。0.25%トリプシン-EDTAを5 mL、血清学的ピペットで接着した細胞に加えます。トリプシンがすべての細胞を覆うようにフラスコを穏やかに攪拌し、フラスコを37°Cおよび5%CO₂で5〜7分間インキュベー
   トします。
   17. 血清ピペットで細胞に1 mLのアストロサイト培地を加えてトリプシンをクエンチします。血清学的ピペットでフラスコから細胞溶液を抽出し、滅菌済みの15 mL遠心チューブに移します。チューブを200 x gで3分間遠心分離します。
   18. 血清学的ピペットで上清を取り除き、1 mLのアストロサイト培養培地に再懸濁します。チューブを攪拌して、細胞溶液が均一であることを確認します。血球計算盤または自動セルカウンターで溶液中の細胞数をカウントします.
       手記：90%がコンフルエントなフラスコは、通常、約300万個のアストロサイトを生成します。
   19. 10 mLのアストロサイト培養培地をT-75フラスコに加えます。250 μlの細胞溶液(ステップ2.1.18)をマイクロピペットで、すでに培地が入っているT-75フラスコに移し、1:4希釈を行います。フラスコの表面全体に均一な細胞分布を確保するために、穏やかに攪拌します。
   20. ステップ2.1.16〜2.1.19を90%のコンフルエントが達成されるたびに繰り返して、細胞を継代する。
2. ラットの胎児からの皮質ニューロンの分離
   1. ステップ2.1.1および2.1.2と同様の調製を行いますが、予温培地は、神経基礎培地+ 2%B-27サプリメント(ニューロン用)+ 1%G-5無血清サプリメント(星状細胞用)+ 0.25%L-グルタミンからなる共培養培地である点が異なります。
   2. 時限妊娠した胚18日目のSprague-Dawleyラットを二酸化炭素窒息で安楽死させ、斬首による死亡を確認します。
   3. ラットの胎児を取り出し、冷やした花崗岩ブロックの表面にHBSSを含むペトリ皿で残りの脳組織から皮質を解剖し、視覚誘導用のステレオスコープと滅菌されたハサミ、マイクロメス、および鉗子を使用します。頭部、脳、大脳半球、および皮質を連続して解剖した後、各組織を新しいHBSS充填シャーレに移します。
   4. 皮質組織を細かく刻んで小さな断片にすることで、トリプシンの表面積を増やします。パスツールピペットで4〜6皮質を5mLの予熱トリプシン-EDTAを入れたチューブに移し、37°Cに維持して組織を解離させます。5〜7分で、チューブを手動で攪拌して混合し、組織の凝集を防ぎます。
   5. 10分後にチューブを37°Cから取り外します。ステップ 2.1 で前述したように、トリプシン EDTA を抽出し、1.8 mL の 0.15 mg/mL DNAse 溶液で置き換えます。その後、溶液が均一になり、液体中に組織片が浮かばなくなるまで、組織をボルテックスします。
   6. 解離した組織溶液を200 x gで3分間遠心分離します。上清を除去した後、2 mLの共培養培地に再懸濁します。この溶液中の細胞数を血球計算盤または自動セルカウンターで数えます.
      手記：通常の収量は3.0-5.0 x 10⁶細胞/皮質半球です。
   7. 上記で定義した共培養培地で、密度が2.0-4.0 x 10⁵細胞/mLの新しい細胞溶液を調製します。

3. マイクロカラム内部のアストロサイトケーブルの開発

1. ECMコア製造
   注:ECMは、細胞播種が行われるのと同じ日に、ハイドロゲルマイクロカラムの内部に追加する必要があります。
   1. バイオセーフティキャビネット内で、滅菌マイクロ遠心チューブ内の共培養培地中のラットテールI型コラーゲンの1 mg/mL溶液を調製します。マイクロ遠心チューブは、使用時を除いて常にECM溶液を氷上に保持してください。
   2. マイクロピペットでECM溶液1〜2μLをリトマス紙のストリップに移し、そのpHを推定します。1 N水酸化ナトリウム(NaOH)または塩酸(HCl)1 μLをマイクロピペットで加えて、ECM溶液のpHをそれぞれ上げたり下げたりし、ピペットで上下させて均質化します。リトマス紙で新しいpHを確認し、必要に応じて、pHが7.2〜7.4の範囲で安定するまで酸または塩基を追加します。
   3. ステップ1.2のシャーレを解剖フードに移し、4〜5本のマイクロカラムまたは滅菌済みの細かい鉗子付きのボートを空の滅菌済み35mmまたは60mmのシャーレに移します。ステレオスコープをガイドとして使用して、マイクロピペットの10μLチップを各マイクロカラムの一端に配置し、吸引してDPBSと気泡の内腔を空にします。ステレオスコープで気泡がないことを確認し、次のステップで追加されたECMがルーメンを横切って自由に流れることができることを確認します。
   4. P10マイクロピペットにECM溶液を充填し、10μLのチップをハイドロゲルマイクロカラムの一端に当て、内腔を満たすのに十分な溶液(約3〜5μL)を送液し、ステレオスコープでECMの入口を観察します。マイクロカラムの両端にECM溶液の小さなリザーバー(2〜4 μL)をピペットで移します
      手記：マイクロカラム構造がしわくちゃになる可能性があるため、構造物の長時間乾燥を防ぐために、常に4〜5本のマイクロカラムまたは一度に1つのボートを管理してください。完全に乾燥したマイクロカラムがペトリ皿の表面にしっかりと付着するため、細胞播種に利用されるのを防ぎます。(水和対策としての)過剰な量の共培養培地をマイクロカラムに添加すると、後述のインキュベーション期間中にECMが流出する可能性があるため、マイクロカラムに添加することはできません。
   5. ペトリ皿の周りのリングに培地をピペットで固定し、インキュベーション中にカラムが乾燥するのを防ぐための湿度シンクを提供します。ECM含有マイクロカラムを含むシャーレを37°Cおよび5%CO₂で1時間インキュベートし、コラーゲンの重合を促進してから、ニューロンおよび/またはアストロサイトを添加します
      手記：ECMは、内部を囲む固体のECMコアではなく、中空ルーメンの内面をコーティングする層を形成する必要がありますが、どちらもステレオスコープを使用して観察できます。ECMがコアを形成する場合は、層のみが残るまでインキュベーション期間を続けます。この層が形成されると、アストロサイト細胞溶液はめっきステップでマイクロカラムの内部を満たすことができます。
   6. インキュベーション期間中に、アストロサイト細胞溶液を調製します(以下に記載)。
2. マイクロカラムにおけるアストロサイトとニューロンの播種
   1. ステップ2.1.16-2.1.19で説明されているように、メッキされたアストロサイト(4番目と12番目の通路の間)を通過させます。フラスコ内の細胞数を数えた後、細胞培養培地に懸濁した5細胞/mL溶液を9.0-12.0×10の密度で細胞溶液を調製します。
   2. ステレオスコープを使用して、P10マイクロピペットの先端をマイクロカラムの一端に置き、十分な細胞溶液(~5 μL)をルーメンに完全に浸します。上記のECMで行ったように、各マイクロカラムの両端に細胞溶液の小さなリザーバーを追加します。
   3. ペトリ皿上に播種したマイクロカラムを37°Cおよび5%_CO2で1時間インキュベートし、ECMへのアストロサイトの付着を促進します。ニューロンをマイクロカラムに追加しない場合は、ステップ3.2.5に進みます。
   4. 最初のインキュベーション期間の後、ステップ2.2.7で得られた皮質ニューロン溶液を1〜2μLをマイクロピペットでマイクロカラムの両端に加え、ステレオスコープで観察します。乾燥を避けるために十分な培地が皿に存在することを確認し、ニューロンの接着を可能にするために、37°Cおよび5%CO₂で40分間再度インキュベートします
      手記：皮質ニューロン溶液は、束形成の1〜2日後にも添加することができ、マイクロピペットでペトリ皿から培養培地を慎重に取り除いた後、ステップ3.2.4を行う。
   5. インキュベーション期間後、めっきマイクロカラムを含むペトリ皿に、35 mmまたは60 mmのペトリ皿用の共培養培地3または6 mLを慎重に充填します。培養中のメッキマイクロカラムを37°Cおよび5%CO₂に維持して、整列したアストロサイトバンドルの自己組織化を促進し、6〜10時間後に束ねられたケーブル状構造を形成する必要があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
鍼(直径300μm)	ラサメディカル	HS.30×40	直径は、マイクロカラムルーメンの所望のサイズに応じて変化させることができます。
ペトリ皿	漁夫	08772Bの
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)	インビトゲン	14200075
ポリスチレン製ディスポーザブル血清ピペット	漁夫	13-678-11D
アガロース	シグマ	A9539-50Gの
マイクロリットルガラスキャピラリーチューブ(701μm)	漁夫	21-170J	直径は、マイクロカラムシェルの所望のサイズに応じて変更することができます。
マイクロキャップバルブディスペンサー	漁夫	21-170J	バルブにはマイクロキャップチューブが付属しています。
ホットプレート	漁夫	SP88857200
マグネットバー	漁夫	1451352
マイクロピペット	シグマ	Z683884-1EA
25mmゲージニードル	漁夫	14*826*49
マイクロメス	ロボズサージカル	RS-6270
鋏	ファインサイエンスツール	14081-09
鉗子	世界の精密機器	501985
ホットビーズ滅菌器	シグマ	Z378550-1EA
実体鏡	ニコン	SMZ800N
マイクロスパチュラ	漁夫	S50821
ラットテールI型コラーゲン	コーニング	354236	4°Cに維持し、必要な場合にのみ取り外します。使用中は氷を使用して温度を保ちます。
マイクロ遠心チューブ	漁夫	02-681-256
水酸化ナトリウム(NaOH)	漁夫	SS2661
塩酸(HCl)	漁夫	SA48-1
リトマス紙	漁夫	09-876-18
ハンクの平衡塩溶液(HBSS)	インビトゲン	14170112	4°Cで保管してください。
0.25%トリプシン-EDTA	インビトゲン	25200056	-20°Cで保管し、37°Cで温めてから使用してください。
ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼ(Dnase)I	シグマ	10104159001	-20°Cで保管し、37°Cで温めてから使用してください。
ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム(DMEM)とハムのF-12栄養素混合物	ギブコ	11330-032	4°Cで保管してください。
ウシ胎児血清(FBS)	アトランタバイオロジカルズ	S11195	-20°Cで保管してください。
出生後0日目または1日目 Sprague Dawleyラットの子犬	チャールズ川	001株
神経基底胚性ニューロン基底媒体	インビトゲン	21103049	4°Cで保管し、37°Cで温めてから使用してください。
B-27 無血清サプリメント	インビトゲン	12587010	-20°Cで保管し、37°Cで温めてから使用してください。
L-グルタミン	インビトゲン	35050061	-20°Cで保管し、37°Cで温めてから使用してください。
G5アストロサイトサプリメント	インビトゲン	17503012
Sprague Dawley胚18ラット	チャールズ川	001株
パスツールピペット	漁夫	22-042816
15 mL遠心チューブ	EMESCO (エムエスコ)	1194-352099
渦動	漁夫	02-215-414
遠心機	漁夫	05-413-115
血球計算盤	漁夫	02-671-6
孵卵器	漁夫	13 998 076