絹コラーゲンを用いた分極神経組織の人工3Dモデルの開発

Abstract

出典:Chwalek, K. et al., Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue.J. Vis. Exp. (2015).

このビデオでは、シルクコラーゲンの足場を利用した3次元分極神経組織モデルの作成を紹介しています。多孔質の絹の足場に神経細胞を播種し、細胞接着のためのインキュベーションを行い、足場にコラーゲンを埋め込むプロセスを詳しく説明し、3D分極神経組織モデルの形成における支持コラーゲンマトリックスの重要性を強調しています。

Protocol

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 絹の足場の準備

1. Bombyx mori繭からの絹溶液の調製
   1. ハサミを使って各繭を8等分に切ります。断片化された繭5gに対して約11個の繭を使用します。(15分)
   2. 2Lの0.02M Na₂CO₃溶液を調製し、ホットプレートを使用して沸騰させます。(15分)
   3. 断片化された繭5 gを秤量し、Na₂CO₃溶液で30分間煮沸します。脱ガムと呼ばれるこのステップは、親水性タンパク質であるセリシンから絹のフィブロインを精製します。(30分)
   4. フィブロインを手で絞り出し、蒸留水で少なくとも3回すすいで、残っているセリシンと化学物質を洗い流します。(5分)
   5. 濡れたフィブロインをペトリ皿に置き、フィブロイン抽出物をフローフードO / Nで乾燥させます。
   6. 翌日、乾燥したフィブロイン塊の重量を量り、ガラスビーカーにフィブロインを入れます。(15分)
   7. フィブロインを9.3 M LiBr溶液に溶解するには、乾燥フィブロインの質量に4を掛けて、LiBrの必要容量(ml)を計算します。絹のフィブロインの上にLiBr溶液をゆっくりと注ぎ、へらを使ってすべてのフィブロイン繊維を浸します。ビーカーを覆って蒸発を防ぎ、60°Cに4時間置いて繊維を溶かします。(15分)
   8. シリンジを使用して、ビーカーからフィブロイン溶液を回収し、MWCO 3,500透析カセットにロードします。蒸留水に対して48時間透析を行います。数時間ごとに水を交換してください。
   9. シリンジを使用して、カセットからフィブロイン溶液を50 mLのコニカルチューブに集め、9,000 rpm(~12,700 x g)で4°Cで20分間遠心分離します。各遠心分離ステップの後、上清を新しいチューブに注ぎ、ペレットを廃棄します。(40分)
   10. 乾燥重量を推定することにより、フィブロインの濃度を測定します。絹溶液1mlを計量ボートに注ぎます。サンプルを60°Cのオーブンで2時間乾燥させます。乾燥シルクフィブロインを秤量し、得られた重量に100を掛けてシルクフィブロイン溶液の濃度を計算します。絹溶液の予想濃度は6〜9%(w / v)です。
   11. シルクの濃度を蒸留水で希釈して6%(w / v)に調整します.
       停止ポイント:液体シルクフィブロインは、密閉容器で4°Cで最大1か月間保存できます。
2. 絹溶液からの多孔質足場の調製。
   1. 粒状NaClをふるいにかけ、後のステップで使用する500〜600μmの顆粒を分離します。500 μm未満および600 μmを超えるサイズの顆粒を廃棄します(15分)
   2. ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)型に30mlの6%シルク溶液を注ぎます(図1)。ふるいにかけたNaCl60 gを絹の上にやさしく散らします。容器を軽くたたいて、均一な塩の層を作ります。RTで48時間インキュベートして、絹を重合します。
   3. 足場を含むPTFE型を60°Cのオーブンに1時間置いて重合を完了し、残りの液体を蒸発させます。
   4. PTFE型の内容物を2Lの蒸留水が入ったビーカーに48時間入れて、塩分を浸出させます。1日2〜3回水を交換してください。塩が完全に浸出したら、スポンジの足場を型から取り外します.
      停止場所:スポンジは、足場の脱水を防ぐために、密閉容器に4°Cの水に浸して保管できます。
   5. 準備ができたら、直径5mmの生検パンチで足場を切り取ります。足場をあらかじめカットして、高さが約2mmになるようにします。直径2mmの生検パンチで足場の中央を打ち抜きます(図2A)。(1時間)
   足場を
   6. 水に浸してオートクレーブで滅菌します(湿式サイクル、121°C、20分).
      停止場所:スポンジは、足場の脱水を防ぐために、密閉容器に4°Cの水に浸して保管できます。
   7. 計画された細胞播種の前に、足場を滅菌済みの0.1 mg/mlポリ-D-リジン(PDL)溶液に浸します。37°Cで1時間インキュベートします。
   8. 足場をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄し、非結合PDLを除去します。(30分)

>2. ラット皮質ニューロンの分離

1. 承認された動物プロトコルが得られた後、胚の18日目(E18)Sprague-Dawleyラットから皮質を解剖します。(2時間)
2. 10皮質を5 mLの0.25%トリプシンと0.3% DNase I(ウシ膵臓由来)に溶かし、37°Cで20分間インキュベー
トします。
3. 1 mg / mlの大豆タンパク質を追加してトリプシンを不活性化します。.
4. 10 mLのパスツールピペットを使用して、単一細胞懸濁液が生成されるまでピペッティングを20回上下させることで皮質を粉砕します。穏やかに、気泡の形成を避けてください。(10分)
5. 細胞懸濁液を127 x gで5分間遠心分離します。
6. 細胞ペレットを10 mLの培養培地(神経基礎培地、1x B27サプリメント、1x Glutamax、1%ペニシリン/ストレプトマイシン)に再懸濁します。セルを数えます。予想される細胞濃度は約2x10⁷/mlです(20分)。

3. 組み立てと文化の構築

1. 細胞による足場播種
   1. 滅菌スキャフォールドと必要なすべての器具を細胞培養フード内に移動します。滅菌鉗子を使用して96ウェル細胞培養プレートに足場を置き、ウェルごとに1つの足場を割り当てます。(10分)
   2. スキャフォールドを細胞培養培地に浸して平衡化してから、細胞播種を行います。37°Cで1時間インキュベートします(10分)
   3. 足場から余分な培地を吸引します。
   4. 100 μlの細胞懸濁液/スキャフォールドを塗布します。(10分)
   5. 細胞を37°C O / Nでインキュベートして、細胞を足場に付着させます。
   6. 翌朝、付着していない細胞を吸引し、新鮮な培地を200 μl/ウェルで塗布します。(10分)
2. コラーゲンマトリックスによる足場埋め込み。(2時間)
   1. 10x PBS、水、1 N NaOH、ラットテールIコラーゲンを氷の上に置きます。製造元の指示に従って、コラーゲンの作業溶液を準備します。細胞播種コンストラクトの準備が整うまで(最大1時間)、氷上で保持します。
   2. 細胞播種絹コンストラクトをインキュベーターから取り出し、余分な培地を吸引します。
   3. 滅菌鉗子を使用してウェルプレート上の空のウェルに足場を移し、各足場を100 μlの3 mg/mlコラーゲン溶液に浸します。組織培養プレートをインキュベーターに30分間戻し、コラーゲンの重合を可能にします。
   4. 温めた細胞培養液/ウェル100 μlを適液します。コンストラクトを1週間培養し、毎日、媒体の半分の量だけを交換して媒体を交換します。

Results

図 1.シルクスポンジ足場の準備に使用されるPTFE型。寸法:直径10cm、高さ2cm。

図2. 3D脳のような組織モデル。(A)多孔質シルクスポンジ足場。 (B)コラーゲン埋入前のシルク足場への播種による1日目のニューロンの生死染色(緑色生細胞、赤色死細胞)。右側のパネルは、赤枠で囲まれた領域の倍率を示しています。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
遠心分離機 5804 R	エッペンドルフ
ポリ-D-リジン	シグマ・アルドリッチ	P6407-5MG	最終濃度 10 μg/mL、水に溶解
神経基礎媒体	ギブコ	21103049	使用前に37°Cまで温めてください
B27サプリメント50倍	ギブコ	17504-044
グルタマックス	ギブコ	35050-061
ペニシリンストレプトマイシン	コーニング	30-002-CIの
コラーゲンI、ラットテール、100mg	コーニング	354236	最終濃度3mg / ml
NaOH	シグマ・アルドリッチ	S2770	腐食 性
PBSの	シグマ・アルドリッチ	D1283-500ミリリットル
Na2CO3	シグマ・アルドリッチ	223530
LiBr	シグマ・アルドリッチ	213225
MWCO 3500透析カセット	サーモフィッシャー	66110
ヒーティングプレート	フィッシャーサイエンティフィック	アイソテンプ
篩	フィッシャーサイエンティフィック	270号機、35号機、30号機
PTFE製			自社製型(図1)直径10cm、高さ2cm
NaCl	シグマ・アルドリッチ	71382
生検パンチ5mm	世界の精密機器	501909
生検パンチ 2 mm	世界の精密機器	501908
トリプシン	シグマ・アルドリッチ	T4049-500ミリリットル
DNase	ロシュ	10104159001	最終濃度 0.3%
大豆タンパク質	シグマ・アルドリッチ	T6522-100MG	最終濃度1mg / ml