ヒト多能性幹細胞由来の分化ニューロンの再プレーティング

要約

出典: Calabrese, B. et al., Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation. J. Vis. Exp. (2019)

このビデオでは、マイルドなタンパク質分解酵素を使用して、ヒト多能性幹細胞由来のニューロンを分離して植え替える方法を紹介しています。ろ過と遠心分離の後、ニューロンはコーティングされたマルチウェルプレートに再播種されてインキュベーションされ、付着と成熟が促進されます。

プロトコル

>1. 再めっき前の微分期間

1. ニューロンがそれらのプロセスと厚いネットワークを形成し、MAP2やTuJ1などの初期のニューロンマーカーだけでなく、NeuNなどの後期マーカーも発現するまで、選択したプロトコルを使用して、10cm皿のニューロンを区別します。
2. ニューロンの分化プロセス中に4日ごとに選択する媒体の半分を交換します.
   手記： より広範囲または頻繁な培地の変化は、必須の栄養因子を希釈し、成熟を好まない可能性があります。
   1. iPSC由来WT126ニューロンには、次の分化後培養培地を使用してください:5 mL 100x N2(神経)サプリメント、10 ng/mL脳由来神経栄養因子(BDNF)、10 ng/mLグリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)、1 μg/mLラミニン、200 μMアスコルビン酸、1 μMジブチリル-cAMP、および500 mLダルベッコ改変イーグル培地/栄養混合物F-12(DMEM/F12)用の10 mL SM1。徐々に、ハーフメディアの変更を使用して、神経基礎媒体(材料の表)と同じサプリメントに置き換えます。
   2. 人工多能性幹細胞または iPSC 由来 CVB WT ニューロンには、500 mL 神経基礎 A 培地 (材料表) および 500 mL DMEM/F12 培地 (2 μg/mL ラミニンを含む)、10 mL グルタミンサプリメント (材料表)、0.75 mg/mL 重炭酸ナトリウム、5 mL 最小必須培地 (MEM) 非必須アミノ酸、 0.2 mM アスコルビン酸、10 ng/mL BDNF、20 mL 50x B27、および 10 mL 100x N2 サプリメント。

2. マルチウェルのコーティング

1. 再めっきの前日に、ポリ-L-オルニチン(PLO)でコーティングします。PLOを滅菌水に溶解して、ストック溶液(10 mg / mL)を作ります。このストックを-20°Cで保存し、PLOを水で1:100に希釈して、ガラスをコーティングする場合は50 μg/mL、プラスチックをコーティングする場合は1:1,000の比率(10 μg/mL)の濃度になるようにします。
2. ターゲットプレートに直接コーティングを塗布します。プレートサイズに適したコーティング量を使用します(つまり、24ウェルプレートの場合、ウェルあたり500μLのPLO溶液を塗布します)。
3. プレートを室温で一晩暗闇に置いておきます。
4. 再めっきの日にコーティングされたプレートを回収し、滅菌済みのバイオセーフティキャビネットに移します。
5. PLO溶液を吸引し、滅菌水で2回すすいでください。
6. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)でラミニン(1.15 mg/mL)を1:400希釈で希釈します.
   手記： ラミニンを4°Cで解凍し、ラミニンの凝集やコーティングムラを避けるために、PBSに素早く添加します。
7. 滅菌水を吸引し、以前にPLOでコーティングされたウェルに500μLのラミニンコーティングを塗布します。
8. プレートを37°Cのインキュベーターに最低4〜6時間置き、ガラス表面には最大16時間の長いインキュベーションを使用します。一貫したインキュベーション時間を使用してください。

3. 分化ニューロンの再めっき

1. 分化したニューロンのプレートをPBSで一度やさしくすすいでください。PBSは、細胞が破壊されないように、直接細胞上ではなく、プレートの壁に穏やかに分散させます。
2. PBSは、細胞に直接触れないように注意しながら、研究者に向かって傾けながら皿の端から吸引するように注意しながら、PBSを穏やかに吸引します。
3. 10 cmプレートあたり最低1 mLのタンパク質分解酵素(Table of Materials)を適用し、細胞をインキュベーターに戻します。低湿度のために組織培養室が高い蒸発速度を示す場合は、わずかに高い容量を追加します。
4. 細胞をプレートから分離し、ニューロンネットワーク内の他のニューロンから細胞を分離するために、タンパク質分解酵素で40〜45分間インキュベートします
   手記： このステップのタイミングは重要です。プロテアーゼのクエンチが早すぎると、再プレーティング後の細胞死が増加する可能性があります。タンパク質分解酵素の製造業者は、継代細胞株のインキュベーション期間を長くして37°Cよりはるかに低い温度を使用することを推奨しています(例:4°Cで一晩)。ただし、4°Cでのニューロンの取り扱いは、寒冷暴露後に生存率が低いことが多いため、避けるべきです。また、この酵素を37°Cで60分間インキュベートすると、酵素が不活性化されると述べています。しかし、著者らの経験では、hiPSC由来の神経細胞培養物を37°Cで40〜45分間インキュベートするだけで、効率的な解離と再プレーティング時の優れた神経細胞の生存には十分です。
5. インキュベーション時間中に位相差顕微鏡でニューロンをチェックし、顕微鏡下でプレートを短時間振ると神経ネットワークがプレートから完全に分離し、小さなシートに分裂し始めるまでプロテアーゼ処理を継続させます。
6. 10 cmプレート中のプロテアーゼ1 mLあたり5 mLの新鮮なDMEM培地を使用してプロテアーゼ活性をクエンチし、消化を停止します。細胞をプレートに対して5〜8回穏やかに粉砕し、血清学的ピペットを使用してネットワークを破壊します。分化したニューロンは壊れやすいため、トリチューションの際には圧力をかけすぎないように注意してください。P1000チップは、先端が鋭すぎて狭すぎるため、ニューロンが透けたり損傷したりする可能性があるため、使用しないでください。
7. 直径100 μmのメッシュのセルストレーナーを介して、細胞の入った溶液を新鮮な50 mLのコニカルチューブに一滴ずつ塗布します。
8. 細胞がろ過された後、さらに5 mLの新鮮なDMEM培地でストレーナーをすすぎます。
9. 卓上遠心分離機で細胞を1,000 x gで5分間スピンします。
10. コニカルチューブをバイオセーフティキャビネットに戻し、ほとんどの培地を吸引し、細胞が水分を保持するように約250μLを残します。
11. 細胞を2 mLの新鮮なDMEM培地に穏やかに再懸濁します。ペレットをチューブの側面にピペットで固定しないでください。代わりに、円錐形のチューブを2〜3回静かに反転させ、細胞を5mLの血清学的ピペットの端に通して細胞を取り除きます。
12. 10 μLの再懸濁ニューロンを血球計算盤の端に塗布します。
13. 細胞の液滴に8〜10 μLのトリパンブルーを添加して、この再懸濁ステップ中の細胞生存率を評価します。この混合物10μLを血球計算盤またはその他の自動セルカウンターに塗布します。位相が明るく、トリパンブルー色素を除外する細胞を生存可能と評価します。
14. 生細胞量/mLを決定し、所望の細胞密度に従ってコニカルチューブの内容物を希釈する準備をします。
15. プレートは、384ウェルプレートの場合はウェルあたり~10,000細胞、24ウェルプレートの場合はウェルあたり~150,000-200,000細胞です。
16. 再懸濁細胞の円錐管に新鮮なDMEMを添加して適切な希釈を達成し、特定の細胞株の要件に応じてB27やBDNFなどの適切なサプリメントを追加します。
17. 円錐形のチューブをゆっくりと傾けて2〜3回混ぜます。
18. 24ウェルプレートまたは384ウェルマルチウェルプレートから16チャンネルピペットを使用してラミニンコーティングを吸引し、PBSで1回すすぎます。
19. 24ウェルプレートにはP1000を、384ウェルプレートには16チャンネルピペットを使用してPBSを吸引します。
20. 細胞溶液を8の字型の動きで各ウェルに塗布し、凝集を防ぎます。めっきの均一性は、自動化された液体処理装置を使用して最適化することもできます.
    手記： 再プレーティングの2〜4日後にラミニンを培地に添加することも、細胞の均一な分布を維持するのに役立ちます。
21. 各ウェルについて、ステップ 3.19 と 3.20 を繰り返します。
22. プレートをインキュベーターに戻し、37°C、二酸化炭素5%に設定します。
23. 2日後、セクション1.2で説明した分化後培養培地を使用して、4日ごとに培地の半分を交換し始めます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
L-アスコルビン酸	シグマ	A4403の	1LのN2B27培地に200mMストック1mlを添加
ジブチリル-cAMP	シグマ	D0627	1 μM を追加します
ヒトBDNF	ペプロテック	450から02	10 ng/mL 最終濃度
B27 (50倍速)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	17504044	1L N2B27培地に20 mLを加え
DMEM/F12 グルタマックス	サーモフィッシャーサイエンティフィック	31331093	N2 を添加し、50 mL の円錐形に分配します。パラフィルムで蓋を包
ヒトGDNF	ペプロテック	450から10	10 ng/mL 最終濃度
グルタマックス	サーモフィッシャーサイエンティフィック	35050038	1L N2B27培地に10 mLを加え、グルタミンサプリメント
マウスラミニン	シグマ	P3655-10ミリグラム	N2B27 50 mLに100 μlを添加
MEM非必須アミノ酸	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11140035	1L N2B27メディアに5mlを追加します
N2(100X)サプリメント	ライフテクノロジー	17502048	500mL培地に5mlを添加
神経基礎Aメディア	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10888022	DMEM/F12と組み合わせて、CVB wt細胞用のN2B27培地を作製します。神経基底A培地
神経基礎メディア	サーモフィッシャーサイエンティフィック	21103049	WT126細胞用;神経基底培地
SM1サプリメント	StemCellテクノロジー	5711	メディアに1:50を追加する
炭酸水素ナトリウム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	25080から094	1L N2B27培地に10mlを加え
プレートの準備
10cmティッシュカルチャーディッシュ	フィッシャーサイエンティフィック	08772-E	プラスチックTC処理された皿
6ウェル組織培養ディッシュ	トーマス・サイエンティフィック	1194Y80	NESTプレート
マウスラミニン	ライフテクノロジー	23017-015	プラスチックに1:400を追加します
ポリオルニチン	v	P3655-10ミリグラム	プラスチックに1:1000を追加
UltraPure蒸留水	ライフテクノロジー	10977-015	ポリ-L-オルニチンを希釈するには
試薬の再めっき
100mMセルストレーナー	コーニング	431752	滅菌済み、個別包装
384ウェルプレート、コーティングなし	パーキンエルマー	6007550	PLOとラミニンでコーティング
DPBSの	ライフテクノロジー	14190144	ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水
Poly-D-Lysine-Precoated 384ウェルプレート	パーキンエルマー	6057500	ラミニンでコーティングする前にすすいでください