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1. フォトリソグラフィーによるSU-8モールド作製
>注:この手順には危険な化学物質が含まれます。全体にヒュームフードとPPEを使用してください。
- シリコンウェーハ(直径4インチ、厚さ1mm、研磨済み)をアセトンで洗浄し、窒素ガスで吹きます。その後、180°Cで3分間焼き、乾燥させます。
- 洗浄したウェーハに 3 mL の SU-8 2100 を分注します。
- スピンコーターでSU-8を500rpmで10秒間ウェーハ上に均一にコーティングした後、1500rpmで30秒間、加速度300rpm/sで連続スピンして、厚さ150μmのSU-8.
層を得る
注:シリコンウェーハがスピンコーターの中央に配置され、真空で正しく固定されていることを確認してください。
- ホットプレート上でウェーハを50°Cで10分間、65°Cで7分間、95°Cで45分間ソフトベークします。
- フォトマスク(図1)をマスクアライナーにセットし、UV光(365nm)を60 s.
露光します
注:露光時間は、適切な量のUV光によって最適化する必要があります。
- 露光後、ホットプレート上でウェーハを65°Cで6分間、95°Cで13分間ベークします。
- SU-8現像液でオービタルシェーカーを用いた攪拌を行い、10〜20分間ウェーハを現像し、プロセス中に一度現像液を変化させます
注:SU-8の破片が残っている場合は、現像時間を延長してください。
- ウェーハをイソプロパノールですすぎ、窒素ガスでウェーハをやさしく乾燥させます。
- 蒸着したSU-8の高さを測定顕微鏡で測定し、厚さが約150μmであることを確認します。常温で無期限保存が可能です。
2. ポリジメチルシロキサン(PDMS)マイクロ流体を用いた組織培養チップの作製
- SU-8蒸着したウェーハを容器(15cmプラスチックシャーレなど)に両面テープで固定します。
- 窒素ガスを使用してウェーハからほこりを吹き飛ばします。
- シラン化するには、SU-8蒸着したウェーハを小さな容器(35mmディッシュなど)と一緒に真空チャンバーに入れます。10 μLの(トリデカフルオロ-1,1,2,2-テトラヒドロオクチル)-1-トリクロロシランを小さな容器に滴下します。SU-8ウェーハに(トリデカフルオロ-1,1,2,2-テトラヒドロオクチル)-1-トリクロロシランを直接塗布しないでください。
- 真空チャンバーをしっかりと閉じ、真空ポンプを少なくとも2時間オンにします。
- プラスチックカップにシリコンエラストマー(Silpot 184など)と硬化剤を10:1の重量比で注ぎます。その後、スパチュラでよく混ぜ、真空チャンバー内で気泡が完全になくなるまで脱気します。
- PDMS混合物をSU-8ウェーハと一緒に容器に所望の厚さ(3〜4 mm)に注ぎ、再度脱気して気泡を取り除きます。
- PDMSを60°Cのオーブンで少なくとも3時間焼き、PDMSを完全に硬化させます。
- 冷却後、メスやカミソリの刃で硬化したPDMSをウェーハから切り取ります。
- 組織培養チップの2つのチャンバーを作成するには、直径1.5mmの生検パンチを使用して、2つのコンパートメントが配置されている場所に2つの穴を開けます。
- 中程度のリザーバーを作成するには、別のPDMS混合物(シリコーンエラストマーと硬化剤を10:1の重量比で)を準備し、新しい10cmのシャーレに注ぎます。注湯量をPDMSの厚さ5mmに調整します。
- PDMSを60°Cのオーブンで少なくとも3時間焼き、PDMSを完全に硬化させます。
- PDMSを冷却した後、硬化したPDMSをメスで切り取り、長方形のリングを作ります。
- 未硬化のPDMSをそれらの間に適用し、組み立てられたPDMS層をベークすることにより、最下層を媒体リザーバーに接着します。この結合構造により、PDMS組織培養チップが生まれます。
- PDMS組織培養チップをスコッチテープで洗浄し、表面のほこりや小さな粒子を取り除きます。PDMS組織培養チップは、ほこりや紫外線から保護されていれば、室温で保存できます。
3. 文化の準備
- 培地
手記：以下にリストされているすべての媒体は、特に明記されていない限り、滅菌のためにろ過する必要があります。調製した培地は4°Cで保存し、1ヶ月以内に使用できます。
- mTeSR Plus培地を調製するには:100 mL mTeSR Plus 5xサプリメント1本と400 mL mTeSR Plus Basal Medium1本を組み合わせます。
- 100 mLのKSR培地を調製するには:85 mLのDulbecco's Modified Eagle MediumまたはDMEM / F12に、15 mLのノックアウト血清補充薬(KSR、15%)、市販のグルタミンサプリメント1 mL(1%)、および1 mLの非必須アミノ酸(NEAA、1%)を追加します。
- 100 mLのN2培地を調製するには:100 mLのNeurobasal培地に、1 mLのN2(100x)、市販のグルタミンサプリメント1 mL、および1 mLのNEAAを加えます。
- 250 mLの成熟培地を調製するには:250 mLのニューロベース培地に、5 mLのB27(2%)、2.5 mLの市販のグルタミンサプリメント(1%)、および2.5 mLのペニシリン/ストレプトマイシン(1%)を追加します。.
- 化合物(レチノイン酸(RA)、SB431542、LDN-193189、SU5402、DAPT、SAG、Y-27632)を細胞培養グレードのDMSOで目的の濃度に再懸濁します。アリコートを調製し、-20°Cで最大6ヶ月間保存します。1 mM RA、10 mM SB431542、100 μM LDN-193189、10 mM SU5402、10 mM DAPT、1 mM SAG、10 mM Y-27632 のストック溶液を使用します。
- コーティング
手記： 熱による基底膜マトリックスの重合を防ぐために、凍結融解のサイクルを繰り返さないでください。可能であれば、予冷されたピペットチップとチューブを使用して、すべてのコーティング手順を処理します。基底膜マトリックスは、4°Cで一晩解凍し、事前に冷却したピペットチップとチューブを使用して分注する必要があります。アリコートは-20°Cまたは-80°Cで凍結できます。
- 冷凍アリコートを氷の上で4°Cで解凍します。コーティング手順中は、アリコートを冷たく保つ必要があります。予冷したピペットチップを使用して、基底膜マトリックスを氷冷DMEM/F12で1:40の比率で希釈します。未使用の希釈基底膜マトリックスは、重合が起こらなかった場合、4°Cで2〜3日間保存できます。
- 基底膜マトリックス/DMEM-F12溶液1 mLを添加し、6ウェルプレートの1ウェルをコーティングします。
- プレートを室温で少なくとも1時間、または一晩4°Cでインキュベートします。コーティングされたプレートは、4°Cで最大1週間保存できます。
>4. iPS細胞のメンテナンス
- ステップ3.2で前述したように、基底膜マトリックスコーティングディッシュを準備します。
- mTeSR Plus培地を完全吸引します。ウェルをPBSで一度洗浄し、0.5 mLの継代試薬を加えます(材料の表を参照)。数秒待ってから、解決策を吸引します。
- プレートをインキュベーター内で37°Cで5分間、または細胞が丸くなるまでインキュベートします.
手記： インキュベーション時間は、iPS細胞株とコンフルエンシーによって異なる場合があります。インキュベーション中の解離時間を決定するために、顕微鏡で定期的にチェックしてください。
- 1 mLのmTeSR Plus培地を加え、プレートを30〜60秒間軽くたたいてコロニーを剥離します。
- 1 mLの細胞懸濁液を7 mLの新鮮なmTeSRと培地と穏やかに混合します。5回以上ピペットで挟まないでください。
- 1:8の比率でプレートします。通常、ステップ5.5の懸濁液1 mLを添加し、1 mLのmTeSRと5〜10 μMのY-27632(ROCK阻害剤)を添加した培地を加えます。通過希釈倍率はiPS細胞ラインにより異なります。
- 細胞を5% CO2/37°Cインキュベーターに入れます。翌日、新しいmTeSR Plus培地を追加してY-27632を取り外してください。その後、最初は隔日で培地を交換し、細胞の密度が高くなると毎日交換します。
5. iPS細胞の運動ニューロンへの分化
- 運動ニューロン分化のための継代iPS細胞
手記： 3D(5.2)プロトコルで差別化を成功裏に行うことができます。
- 未分化のiPS細胞を、6ウェルプレートのmTeSR Plus培地で約80%のコンフルエントに達するまで増殖させます。
- 媒体を完全に吸引します。直ちにウェルを滅菌PBSで一度洗浄し、0.5 mLの細胞解離溶液を細胞に加えます。
- プレートをインキュベーター内で37°Cで約2〜3分間、または細胞が分離して丸くなるまでインキュベートしますが、ウェルに付着したままになります。
- 1 mLの培地を加え、5 mLの血清ピペットを使用して数回ゆっくりとピペットを上下させます。細胞懸濁液を4 mLの培地からなる15 mLチューブに移します。
- 200 x gで3分間遠心分離します。
- ペレットを乱さずに上清を慎重に吸引し、10 μMのY-27632を添加した培地1 mLに細胞を再懸濁します。
- 血球計算盤を使用して細胞をカウントし、5.2(3D分化)のいずれかに進みます。
- 3次元分化における運動ニューロンスフェロイド(MNS)の形成(「3Dプロトコール」)
手記： 完全な培地交換は、分化の0日目から12日目まで毎日行われます(図2)。
- ステップ 5.1.7 の iPS 細胞を 96 ウェル U 底板に 40,000 細胞/ウェルで播種し、100 μL の mTeSR Plus に 10 μM の Y-27632 を添加します。
- 翌日、各ウェルを100 μLの新鮮な培地と交換します。
- 0日目と1日目:培地を吸引し、10μMのSB431542と100nMのLDN-193189を添加した100μLのKSR培地(3.1.2)と交換します。
- 2日目と3日目:培地を吸引し、10 μM SB431542、100 nM LDN-193189、5 μM DAPT、5 μM SU5402、1 μM RA、および1 μM SAGを添加した100 μLのKSR培地と交換します。
- 4日目と5日目:75%KSR培地と25%N2培地(3.1.3)からなる混合培地を準備します。次に、培地を吸引し、10 μM SB431542、100 nM LDN-193189、5 μM DAPT、5 μM SU5402、1 μM RA、および 1 μM SAG を添加した 100 μL の混合培地と交換します。
- 6日目と7日目:50%KSR培地と50%N2培地からなる混合培地を準備します。次に、培地を吸引し、5 μM DAPT、5 μM SU5402、1 μM レチノイン酸、1 μM SAG を添加した 100 μL の混合培地と交換します。
- 8日目と9日目:25%KSR培地と75%N2培地からなる混合培地を準備します。次に、培地を吸引し、5 μM DAPT、5 μM SU5402、1 μM RA、および 1 μM SAG を添加した 100 μL の混合培地と交換します。
- 10日目と11日目:培地を、5 μM DAPT、5 μM SU5402、1 μM RA、1 μM SAGを添加した100 μLのN2培地と交換します。
- 12日目:MNを組織培養チップに移す(ステップ6)に進むか、培地を100μLの成熟培地(3.1.4)に20 ng / mLの脳由来神経栄養因子(BDNF)を補充して交換します
手記：MNSは、12日目から19日目まで組織培養チップに移すことができます。移管されていないスフェロイドは、移管するまで、20 ng/mL BDNFを添加した成熟培地で96ウェルU底板で培養する必要があります。
>6. 運動神経オルガノイド(MNO)形成のための組織培養チップの調製
- 調製したPDMS(ステップ2.13から)をペトリ皿の70%エタノールに少なくとも1時間浸して滅菌します
手記：以下のすべての手順は、バイオセーフティキャビネットで操作する必要があります。
- 顕微鏡ガラス(76 x 52 mm)をペトリ皿の70%エタノールに浸して滅菌します。
- 顕微鏡ガラスの乾燥プロセス中に、PDMSデバイスを半分湿った顕微鏡ガラスに置き、一晩待って完全に乾かします。完全に乾燥したら、PDMSデバイスはガラスに接着する必要があります.
手記： この結合は、組織採取のための培養後にPDMSデバイスを顕微鏡ガラスから取り外すことができるように恒久的なものではありません。酸素プラズマによる永久結合は、PDMSとガラスとの接着性を最大限に高めるために使用できますが、チップの分解や組織採取を禁止します。
- PDMSデバイスおよび顕微鏡ガラスのマイクロチャネルの表面をDMEM/F12(1:40)の希釈基底膜マトリックス30 μLでコーティングし、チャネルの入口の片側に液滴を作り、入口の反対側からピペットまたは吸引ポンプで溶液を吸引します(図3A)。気泡の汚染を避けるために、溶液の量を多すぎないでください。
- 次に、PDMSデバイスを室温で1時間、または4°Cで一晩、二次容器(ペトリ皿など)でインキュベー
トします。
>7. 運動神経オルガノイド(MNO)の形成
- コーティング溶液を、使用直前に20 ng/mLのBDNFを添加した150 μLの熟成培地と交換してください。
- 次に、ステップ5.2.9のMNSを、先端がワイドボアのマイクロピペットを使用してマイクロチャネルの入口に入れます。MNSは、重力によってデバイスの底部に自発的に落ち着くことができます。MNSを注入するときは、圧力をかけすぎないでください(図3B).
手記： MNSが組織培養チップの穴の側壁に詰まっている場合は、入口の別の側から溶液を穏やかに吸引します。
- 小さなリザーバー(例:15 mLチューブのキャップ)に滅菌水を入れ、培地の蒸発を防ぐために、二次容器内の組織培養チップの近くに置きます。次に、5% CO2/37 °Cインキュベーターに入れます。
- 培地を交換するには、使い果たした培地を培地リザーバーの中心から吸引します(図3C)。すべての培地と組織を吸引しないでください。
- 新鮮な熟成培地(BDNF入り)を穏やかに加えます。培地は2〜3日ごとに交換する必要があります。培養中は、いかなる場合も培地を乾燥させないでください。軸索はMNSからチャネルに成長し、2〜3週間で自然に単一の束に集まり、その結果、MNOが形成されます。MNOは、デバイス内でさらに1か月以上培養できます。
