冷気プラズマ処理による神経幹細胞分化の促進

Abstract

出典:Xiong, Z., et al. Nerve stem cell differentiation by a one-step cold atmospheric plasma treatment in vitro. J. Vis. Exp. (2019年)。

この動画では、低温の大気プラズマを利用して神経幹細胞の分化を誘発する方法を紹介しています。これにより、紫外線と反応性分子が生成され、神経細胞を刺激して投射を生成し、ニューロン細胞の分化を示します。

Protocol

1. 細胞培養と分化前

1. 神経幹細胞の培養と分化前
   1. ポリ-D-リジンコーティングされたカバースリップを準備します。滅菌カバースリップ(直径20 mm)を12ウェルプレートに入れます。次の手順に従って、カバーガラスにポリ-D-リジン(0.1% w/v)を水でコーティングし、カバーガラスへの細胞接着を改善します。
      注:最適な条件は、細胞株とアプリケーションごとに決定する必要があります。
      1. カバーガラスの表面をポリ-D-リジン、0.1% w/v、水中で無菌的にコーティングします。カバースリップの表面が均一にコーティングされるように、優しく揺らします。
      2. 37°Cで一晩(~12時間)培養した後、ポリ-D-リジン溶液を取り出し、1mLの滅菌水で表面を3回すすいでください。
      3. 播種する前に、細胞を少なくとも30分間乾燥させます。
2. マウス神経幹細胞C17.2(C17.2-NSC)の培養と分化前
   1. C17.2-NSCをダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)の25 cm²フラスコでインキュベートし、10%ウシ胎児血清(FBS)、5%ウマ血清(HS)、1%ペニシリン/ストレプトマイシンを37°Cおよび5%CO2で~2 - 3d添加します。
   2. 細胞が85%のコンフルエントに達したら、培地を取り出し、1 mLのPBSで細胞を洗浄し、1 mLの新鮮なトリプシン(0.25%)をフラスコに加えます。1分間放置します。次に、1 mLの培地をフラスコに加え、ピペットで数回上下させて、単一細胞懸濁液を確保します。
   3. 血球計算盤を使用して、懸濁液中の細胞の密度をカウントします。細胞懸濁液の必要量を計算して、最終細胞濃度を 2 x 10⁴ cells/mL にします。
   4. 12ウェルプレートのコーティングされたカバースリップにC17.2-NSCを、ウェルあたり2~10⁴セルの密度で播種します。顕微鏡で細胞密度を確認します.
      注:より良い結果を得るには、免疫蛍光実験の前に最適な細胞密度を決定する必要があります。
   5. 細胞を37°Cのセルインキュベーターで12時間インキュベートし、接着させます。
   6. 接着後、細胞を1mLのPBSで2回洗浄し、DMEM/F12と1%N2サプリメントからなる分化培地で、血漿処理の48時間前に細胞を培養します。
3. 初代ラット神経幹細胞の培養と分化前
   1. 初代ラットNSC(神経幹細胞)懸濁液をラットNSC増殖培地中の非コーティングT25フラスコで5×10⁵細胞の密度で培養します。
   2. 倒立顕微鏡下でニューロスフェアの形成を確認します。ニューロスフェアの形態が球状で透明な多細胞複合体を示すことを確認してください。
   3. ニューロスフェアが直径3mm以上に達したら、ニューロスフェア懸濁液を15mLの滅菌遠心チューブに移し、ニューロスフェアを重力で沈殿させます。.
   4. 上清を慎重に取り除き、ニューロスフェアを最小限の媒体に残します。
   5. ニューロスフェアを5mLのPBSで1回すすぎ、ニューロスフェアを重力で落ち着かせます。上清を取り除き、PBSの量を最小限に抑えます。
   6. 適切な量の分化培地を追加して、細胞密度をミリリットルあたり~12〜15ニューロスフェアに調整します。初代ラット神経幹細胞の分化培地は、DMEM/F12、2% B27、1% FBSです。
   7. 1 mLのニューロスフェア懸濁液を12ウェルプレートの各コーティングされたカバースリップに播種します.
      注意: プレートを静かに振って、ニューロスフェアが均等に分布していることを確認します。このステップは、より良い免疫蛍光結果を得るために重要です。
   8. プレートをインキュベーターに入れ、プラズマ処理の24時間前に予備分化させます。

2. プラズマジェットの準備

1. 内径2mm、外径4mmの半開き石英管を選び、管に直径2mmの高圧線を挿入します。
2. 高電圧ワイヤー付きの石英管を5mLシリンジに挿入し、ホルダーを使用してシリンジの中央に取り付けます。石英管の密閉された端とシリンジの先端の間の距離を1cmに設定します。
3. シリンジの開放端に1mのシリコーンゴムパイプ(内径12mm)を接続し、流量計とガスバルブに順番に接続します。

3. ジェッツの買収

1. 図1に示すように回路を接続します。電源の出力線をプラズマジェット装置に接続し、高電圧プローブの先端を出力線に接続して電圧を検出します。高電圧プローブのもう一方の端をオシロスコープに接続して、出力電圧の情報を記録します。回路全体をチェックし、電源、オシロスコープ、および高電圧プローブがすべて接地されていることを確認します。
2. ガスラインを確認してください。ガス管がプラズマジェットデバイスに接続されていることを確認してください。次に、ヘリウム(体積分率99.999%)と酸素(体積分率99.999%)のガスバルブを開き、ガス流量を1 L:0.01 L / min(He:O₂).
   に設定します 注意: 初めて電源をオンにする前に、ガスを数分間流してください。
3. パルス振幅、周波数、パルス幅をそれぞれ8 kV、8 kHz、1600 nsに設定します。回路を再度確認してから、出力ボタンをオンにしてプラズマジェットを作成します.
   注意: 高電圧には触れないでくださいtage いかなるときもワイヤー。

4. 神経幹細胞の血漿治療

1. シリンジのノズルとセルウェルホールの間の距離を15mmに設定します><。 注:距離は、12ウェルプレートが配置されているプラットフォームの底部から測定されます。
2. 12ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、分化前細胞の培地を800 μLの新鮮な分化培地に交換します。
3. 細胞を未処理の対照群、60 s He-and-O₂ (1%) ガス流処理群、60 s プラズマ処理群の 3 つのグループに分けます><。 注:治療条件下では明らかな液体の損失はありません。
4. 12ウェルプレートをプラズマジェットの下に置き、シリンジノズルが各穴の中央に固定されていることを確認し、ステップ4.3.
   で説明したさまざまなグループに関連する処理を行います。 注:未処理のコントロールは、均一な処理条件を確保するために、実験手順中に室温で分化培地に保持されました。He-and O₂(1%)ガス流処理群は、HeとO₂(1%)のガス流のみで処理し、プラズマ発生は行わなかった。すべての治療はトリプリケートで行う必要があります。

5. 神経幹細胞の分化

1. 処理後、元の培養物を取り出し、新しい分化培地1 mLを各ウェルに加えます。
2. インキュベーター内で細胞を37°C、5%CO2で6日間インキュベートし、培地を1日おきに交換します。
3. 図2の逆位相コントラスト光学顕微鏡の下で、さまざまなグループの分化状態を毎日確認してください。少なくとも12のフィールドをランダムに選択し、写真を撮って形態学的変化を記録します。

Results

図1:実験セットアップの概略図。プラズマジェット装置は、高電圧電源の出力線に接続されています。オシロスコープ付きの高電圧プローブは、出力電圧を検出するために使用されます。作動ガスがシリンジを流れ、高電圧がオンになると、プラズマジェットが生成され、屋外に伝播します。

図2:C17.2-NSCおよび初代ラットNSCの通常の倒立位相差光学顕微鏡画像。この図は、許可を得てXiong et al.から引用したものです。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
カバースリップ	巣	801008
ポリ-D-リジン	ビヨタイム	P0128
DMEM媒体	ハイクローン	SH30022.01B	4°Cで保存
DMEM/F12 ミディアム	ハイクローン	SH30023.01B	4°Cで保存
N2サプリメント	ギブコ	17502048	-20°Cで保管し、光から保護します
B27サプリメント	ギブコ	17504044	-20°Cで保管し、光から保護します
ウシ胎児血清	ハイクローン	03 SH30084月	-20°Cで保存し、凍結と解凍の繰り返しを避けてください
ドナーホースセラム	ハイクローン	03 SH30074	-20°Cで引き裂かれ、凍結と解凍の繰り返しを避けてください
ペニシリン/ストレプトマイシン	ハイクローン	SV30010	4°Cで保存
トリプシン	ハイクローン	25300054	4°Cで保存
PBSソリューション	ハイクローン	SH30256.01B	4°Cで保存
4%パラホルムアルデヒド	ビヨタイム	P0098	-20°Cで保存
トリトンX-100	シグマ	T8787
光学顕微鏡	南京江南小説光学会社	XD-202
高電圧パワーアンプ	指向性エネルギー	PVX-4110
DC電源	スペルマン	SL1200
関数発生器	アリジェント	33521Aさん
オシロスコープ	テクトロニクス	DPO3034
高電圧プローブ	テクトロニクス	P6015A型
12ウェルプレート	コーニング	3512
25 cm2フラスコ	コーニング	430639
ヘリウムガス
酸素ガス
プラズマジェットノズル
CO2インキュベーター
シリコンパイプ			内径12mm
マウス神経幹細胞 C17.2 (C17.2-NSC)