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1. メディアの準備
>注:すべてのメディアを37°にウォームアップします。細胞培養に使用する前のC。
- マウス胚性線維芽細胞(MEF)培地(500 mL調製用)
- 50 mLのウシ胎児血清(FBS)を449 mLのDulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)に加え、500 mLの0.22 μmポアフィルターユニットでろ過します。
- ろ過後、1 mLの抗菌剤(50 mg / mL)を追加します。培地は4°Cで最大1ヶ月間保存するか、分注して≤-20°Cで保存してください。
- N2培地(500mL調製用)
- 5 mLのL-アラニン-L-グルタミン(100x)と500 μL 2-メルカプトエタノール(55 mM)を489.5 mLのDMEM:Nutrient Mixture F-12(DMEM/F-12)に加え、500 mLの0.22 μmポアフィルターユニットでろ過します。
- ろ過後、1 mLの抗菌剤(50 mg / mL)と5 mLのN2サプリメント-Bを添加します。メディアは4°Cの暗所で最大1か月間保管してください。
- 無血清増殖培地(KSR)(500mL調製用)
- 75 mLの無血清培地サプリメント、5 mLのL-グルタミン(100倍)、5 mLのMEM非必須アミノ酸(MEM-NEAA)(100倍)、および500 μL 2-メルカプトエタノール(55 mM)を413.5 mLのDMEM含有非グルタミンに加え、500 mLの0.22 μmポアフィルターユニットでろ過します。
- ろ過後、1 mLの抗菌剤(50 mg / mL)を追加します。メディアは4°Cで最大1か月間保存します。
- マウス胚性幹細胞培地(調製用500mL)
- 75 mLの幹細胞グレードのFBS、5 mL MEM-NEAA(100倍)、5 mLのL-グルタミン(100倍)、500 μL の2-メルカプトエタノール(55 mM)をDMEMを含む413.5 mLに添加し、500 mLの0.22 μmポアフィルターユニットでろ過します。
- ろ過後、1 mLの抗菌剤(50 mg / mL)を追加します。培地は4°Cの暗所で最大1か月間保存するか、分注して≤-20°Cで保存します。
2. mESCの培養
- MEF培地中の有糸分裂的に不活性なMEFフィーダー細胞を、組織培養処理したプレートに3-4 x 104細胞/cm2でプレートします。mESCをプレーティングする前に、相対湿度95%、CO2≥5%の37°Cの細胞培養インキュベーターに少なくとも12時間置いてからお待ちください。すぐに使用しない場合は、MEF メディアを 3 日ごとに交換してください。MEFは、めっき後7日以内に使用しない場合は廃棄してください。
- マウス白血病抑制因子(mLIF)(1,000 U/mL)を含むmESC培地中のMEFプレートにmESC(密度範囲1-4 x 104細胞/cm2)を添加します。細胞を37°Cで、相対湿度95%、CO2≥5%でインキュベー
トします。
- トリプシン-EDTA(0.05%トリプシン)(1:5-1:10)を使用したmESCの通過は、ディッシュが~70-80%コンフルエントになったら、またはコロニーが接触し始めた場合。これは通常2日ごとに発生しますが、初期のめっき密度にもよりますが、最大で4〜5日かかる場合があります。
- mESCをmESC培地のMEFフィーダー層に保持して、多能性を維持します。
- 分化を開始する前に、MEFを含まないゼラチンコーティングプレートに細胞を少なくとも1回継代して、MEFを希釈します。
- 組織培養処理皿にCa2+/Mg2+のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で0.1%ゼラチンを添加し、少なくとも1時間37°Cで放置することにより、ゼラチンコーティングプレートを準備します。 プレート1.5-2 x 106細胞/10cmプレート(2.7-3.6×104細胞/ cm2)および分化を開始する前に細胞を2日間増殖させます。
>3. mESCのMGE様末脳前駆細胞への鑑別
- 分化日(DD)0 = 「フロートセル」
- mESCがゼラチンコーティングプレート上で2日間増殖した後、培地を吸引し、Ca2+/Mg2+を含まないPBSで細胞を一度洗浄します。プレートの表面を覆うのに十分なトリプシン-EDTA(0.05%トリプシン)を添加し(通常、10 cmの組織培養皿1枚に4 mLのトリプシン-EDTA)、細胞を37°Cのインキュベーターに戻し、相対湿度は≥95%、CO2は5%で4分間。
- 4分後、mESC培地で2倍の容量を使用してトリプシンEDTAを急冷します。細胞を適切なサイズの遠心チューブに移し、細胞を200 x gで5分間遠心分離します。5分後、チューブを取り外し、ペレットを乱さずにメディアを吸引します。BMP阻害剤LDN-193189(250 nM)およびWnt阻害剤XAV-939(10 μM)を含む1 mL KSR:N2培地(1:1)にペレットを再懸濁します。
- 血球計算盤または自動セルカウンターを使用して細胞濃度を測定します。LDN-193189 (250 nM) および XAV-939 (10 μM) を含むKSR:N2培地 (1:1) に 75,000 細胞/mL を非接着性組織培養皿に添加し、胚様体 (EB) として細胞を増殖させます。細胞を37°Cで、相対湿度95%、CO2≥5%でインキュベー
トします。
- DD1では、組織培養処理済み皿をポリ-L-リジン(PBS中10 μg/mL、Ca2+/Mg2+)で一晩(O/N)、37°C、相対湿度95%≥または少なくとも1時間)コーティングすることにより、細胞の「着地」に備えます。
- DD2 では、ポリ-L-リジンを吸引し、プレートをラミニン (Ca2+/Mg2+) O/N で 37 °C で 37 °C ≥で 95% の相対湿度でコーティングします
手記：O/Nは最適ですが、わずか2時間で十分な場合もあります。翌日までにプレートを使用しない場合は、ラミニンを吸引し、Ca2+/Mg2+を含まないPBSに交換し、4°Cで最大2週間保存してください。
- DD3(「ランドセル」)
- EB解離を開始する前に、ラミニンを吸引し、プレートを組織培養フードで完全に乾燥させます。光沢がある、または目に見えて濡れているように見えるプレートは使用しないでください。培地と共にEBを15mLチューブに移し、15 x gで3〜4分間、またはEBがペレット化されるまで遠心分離します。
- 培地を吸引し、DNaseを含む細胞剥離溶液3 mL(2 U/mL)を加え、≥95%の相対湿度と5%のCO2で37°Cで15分間インキュベー
トします。
- EBが見えなくなったら、または15分が経過したら、DNase(1 U/mL)を含むKSR:N2(1:1)を6 mL添加し、200 x gで5分間遠心分離します。
- LDN-193189 (250 nM)、XAV-939 (10 μM)、および ROCK 阻害剤 Y-27632 (10 μM) を含む KSR:N2 (1:1) の細胞を 4.5-5 x 104 cells/cm2 で播種します。