ハンギングドロップ法によるマウス胚性幹細胞からの神経前駆細胞の生成

要約

出典:Hanafiah, A., et al. Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (2020).

このビデオは、ハンギングドロップ法によるマウス胚性幹細胞(mESC)と胚様体(EB)の分化を示しています。mESCを吊り下げてインキュベートすると、細胞は凝集してEBを形成し、レチノイン酸(RA)を添加した分化培地を用いてさらに神経細胞前駆細胞(NPC)に分化します。

プロトコル

1. mESCの文化

1. 10 cmの組織培養処理プレートに0.1%ゼラチンをコーティングし、ゼラチンを少なくとも15〜30分間硬化させてから吸引します。
2. 予熱したmESC培地(15%ウシ胎児血清(FBS)、非必須アミノ酸、β-メルカプトエタノール、L-グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム、白血病抑制因子(LIF)、PD0325901(PD)、およびCHIR99021(CH))を含むダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM))でmESCを培養する1日前に、マウス胚性線維芽細胞(MEFs)をγ照射して播種する)。
3. γを照射したMEFを沈殿させてプレート表面に付着させてから、E14細胞を培養します。
4. E14 ESCを37°Cのウォーターバスで解凍し、温かいmESC培地を入れた15 cmの円錐形チューブに細胞を迅速に移します。細胞を200 x gで3分間ペレット化し、上清を除去します。
5. 細胞を10 mLのmESC培地に再懸濁し、以前に播種したγ照射したMEFを含む培養プレートに細胞をプレート化します。細胞培養物を37°Cのインキュベーターで5%CO₂未満でインキュベートします。
6. 培養継代では、培地を吸引し、滅菌済みの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)でプレートを洗浄します。プレート表面を覆うのに十分な0.05%トリプシンを添加し、37°Cで3分間インキュベートします。
7. mESC培地とピペットでトリプシンを中和し、単一細胞懸濁液を生成します。細胞を200 x gで3分間遠心分離し、上清を除去します。
8. 血球計算盤またはセルカウンターで細胞をカウントし、10 cmの培養プレートに約5.0 x 10⁵個の細胞を播種します。
9. 細胞を10mLのmESC培地に再懸濁し、ゼラチンでコーティングした組織培養プレート上に細胞を播種し、前述のように培養物をインキュベートします
   手記：mESCは、細胞がコロニー内で分化するのを防ぐために、2日ごとに継代することをお勧めします。培地中のフェノールレッドは、pHインジケーターとしてのみ機能し、細胞密度によっては、2日よりも早く黄色がかった(より酸性)に変わることがあります。したがって、毎日媒体を交換する必要があるかもしれません。γ放射線を浴びたMEFは、数回の通過後に最終的に死滅します。

2. EB、NPC、ニューロンの分化

1. 培養継代プロトコルを実行し、細胞をカウントします。
2. 吊り下げ落とし方法(0日目)
   1. 10 cm細胞培養プレートの場合、約2.5 x 10⁴細胞を数え、5.0 x 10²細胞を20 μL分化培地(15% FBSを含むDMEM、非必須アミノ酸、β-メルカプトエタノール、L-グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン、およびピルビン酸ナトリウム)に懸濁します。細胞を含む約50個の20μL液滴を1枚の10cmプレートに播種できます。
   2. 適切な数の細胞を分注し、細胞を200 x gで3分間遠心分離し、上清を除去します。
   細胞
   3. 密度が20 μLあたり5.0 x 10²細胞になるように、細胞を適切な容量の分化培地に再懸濁します(例:分化培地1 mLに2.5 x 10⁴細胞)。
   4. マイクロピペットまたはリピーターピペットを使用して、細胞懸濁液の液滴20μLを組織培養プレートの蓋に置きます。液滴が合流しないように、液滴が互いに近すぎないようにしてください。
      手記：液滴は、プレート自体ではなく蓋に配置されるため、組織培養処理されたアタッチメントプレートまたは懸濁プレートのいずれかに播種できます。より実現可能で無菌的なアプローチのために、液滴を付着組織培養プレート上にプレートし、以下に説明するように懸濁液プレートに移します。
   5. プレートに5〜10mLの1x PBSを入れ、蓋を慎重にプレートに戻します。37°Cインキュベーターで培養液をインキュベートします.
      手記：PBSを培養プレートに添加して、液滴が乾燥するのを防ぎます。
3. 2日目に、マイクロピペットを使用して蓋から液滴を採取し、10mLの分化培地を充填した10cmの細胞培養懸濁プレートに入れます。インキュベーター内で低速に振とうするオービタルシェーカーで培養物をインキュベートします。
4. 4日目にEBを採取するために、細胞を回収し、200 x gで3分間遠心分離し、上清を除去します
   手記：EBは、その後の実験の要件に応じて、1x PBSで洗浄することもできます。
5. 手順を続行し、EBを神経前駆細胞(NPC)に誘導するには、5μMレチノイン酸(RA)で分化培地を調製します。
6. EBを100 x gで3分間ペレット化して古い培地を取り外すか、EBが沈殿するまで待ってから古い培地を吸引します。5 μM RAを含む分化培地10 mLを培養プレートに加えます。
7. 6日目に、プレートを傾けて上記のように培地をピペッティングして、培地の少なくとも半分を5μMRAを含む新しい培地と交換します
   手記：培地の少なくとも半分を5日目と7日目に新鮮なRA含有培地と交換することをお勧めします。フェノールレッドインジケーターに注意してください。黄色がかった色に変わった場合は、すべての媒体を交換するのが最善です。
8. 8日目に、細胞を採取し、200 x gで3分間遠心分離し、上清を除去してNPCを採取します
   手記：NPCは、その後の実験のニーズに応じて、1x PBSで洗浄することもできます。必要に応じて、NPCを冷凍して再度解凍し、後で培養して分析することができます。NPCを培養する場合は、トリプシンの代替としてアキュターゼを使用することもできます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.05% トリプシン + 0.53mM EDTA 1X	コーニング	25-052-履歴書
0.1%ゼラチン	シグマ	G1890-100G	脱イオン水で調製
CHIR99021	ケイマンケミカルズ	13122
DMEM	コーニング	10-017-CM
DMEM/F12 ミディアム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11320033
EBバッファ	キアゲン	19086
エタノール	111000200	Pharmco(ファーマコ)	脱イオン水で希釈
ウシ胎児血清	アトランタバイオロジカルズ	S10250
L-グルタミン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	25030024
LIF	該当なし	該当なし	MEF上清から採取
MEM 非必須アミノ酸	コーニング	25-025-CL
PD0325901	ケイマンケミカルズ	13034
ペニシリン/ストレプトマイシン	コーニング	30-002-CL
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	該当なし	該当なし	脱イオン水で調製
塩化カリウム	P217-500Gの	VWRの
リン酸カリウム一塩基性無水物	0781-500グラム	VWRの
塩化ナトリウム	BP358-10	フィッシャーバイオ試薬
リン酸ナトリウム、二塩基性、七水和物	SX0715-1	ミリポア
レチノイン酸	シグマ	R2625	DMSOで調製
ピルビン酸ナトリウム	コーニング	25-000-CL
β-メルカプトエタノール	フィッシャーバイオ試薬	BP176-100