造血前駆細胞の神経幹細胞への直接リプログラミング

要約

出典:Wang, T., et al. Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells. J. Vis. Exp, (2015)

このビデオは、遺伝子組み換え造血前駆細胞をニューロン幹細胞に直接再プログラミングする方法を示しています。造血前駆細胞によって発現される転写因子は、それらの形質転換を促進する分子イベントのカスケードを引き起こします。さらに特異的な培地を使用して、誘導されたニューロン幹細胞を選択し、増殖させます。

プロトコル

>1. 神経幹細胞誘導

>注:細胞の状態にもよりますが、トランスフェクションの約5日または7日後に、単層接着細胞は30〜50%のコンフルエンスに達します(図1C)。

1. 浮遊細胞と球体を含む上清を取り除き、1 mLの神経前駆細胞培地(Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)、N2サプリメント1x 1、0.1%(w / v)ウシ血清アルブミン(BSA)、1%(v / v)抗生物質、20 ng / mlの塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)、および20 ng / mlの上皮成長因子(EGF))を接着細胞に加えます。
2. 任意選択で、穏やかにピペッティングし、細胞を170 x gで10分間遠心分離することにより、細胞球を解離し、上清を除去し、バックアップとしてマトリゲルでコーティングされた新しい24ウェルプレートの神経前駆細胞培地1mlに細胞を再懸濁する。
3. 細胞が60〜80%のコンフルエントに達するまで、通常は1週間後に、1日おきに培地を交換します。
4. 上清を捨て、神経幹細胞培地(無血清培地、NSC SFM)1 mLを加えます。細胞スクレーパーを使用して細胞を解離し、その後、非常に穏やかにピペッティングします。
5. 細胞を取り出し、それらすべてを6ウェルプレートの1つのウェルに播種します。さらに1 mLの神経幹細胞培地を加えて、ウェルごとに2 mLの培地を作ります。細胞を37°Cで5%_CO2インキュベーターでインキュベートします。
6. メディアは一日おきに交換してください。
7. 細胞が60%のコンフルエントに達したら、1.4および1.6の手順に従って、細胞を1:3の比率で解離し、再播種します。

結果

図 1.センダイウイルストランスフェクション後のCD34細胞の形態変化(A)トランスフェクション時にかなりの数のCD34細胞が観察される。(B)センダイウイルストランスフェクションの24時間後に球状の細胞凝集体が観察され、時間の経過とともに拡大します。(C)ほとんどの場合、バイポーラ接着細胞はトランスフェクションの5日後に現れた。(DおよびE)神経幹細胞の典型的な形態は、神経前駆細胞培地による誘導および増殖後に示されています。スケールバー:(A)と(B)は200μm、その他は400μm。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
セルスクレーパー	ザルシュテット	83.183
DMEM/F12	ライフテクノロジー	〒12400-024	1倍
N2サプリメント	ライフテクノロジー	17502-048	1倍
ウシ血清アルブミン	シグマ	A2934の	0.1% (w/v)
bFGFの	ペプロテック	100-18B	20 ng/ml
EGFの	ペプロテック	AF-100-15
B27サプリメント	ライフテクノロジー	17504-044	1倍
NSC無血清培地	ライフテクノロジー	A1050901	1倍