出典:Nguyen, B. H., et al.O9-1神経堤細胞の培養と操作。J. Vis. Exp (2018年)
このビデオでは、神経幹細胞の特定の目的遺伝子をサイレンシングし、適切な分化培地を使用して目的の細胞型に分化するための低分子干渉RNA(siRNA)の使用を示しています。この手順により、神経幹細胞の分化過程における特定の遺伝子の重要な役割の研究が可能になります。
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方法論記事
siRNAを介した神経幹細胞における遺伝子サイレンシング
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2025年7月8日
この記事について
要約
プロトコル
1. O9-1細胞の操作
- O9-1細胞におけるsiRNAノックダウンの実施
- 実験を開始する前に、24ウェルプレートを解凍し、基底膜マトリックスでコーティングします。O9-1細胞を回収して播種し、60%から80%のコンフルエント度まで増殖させます。
- リポソームを無血清培地で適切なウェル量に従って希釈します。siRNAを無血清培地で最終希釈します。希釈したsiRNAを希釈したリポソームに、メーカーが推奨する比率で添加します。ピペッティングでよく混合し、インキュベートします.
手記：インキュベーションの使用量、時間、および温度については、製造元のガイドに従ってください。 - メーカーの推奨に従って、適切な量のsiRNA-脂質複合体を細胞に添加してください。
- 標準的な細胞培養インキュベーター(37°C、5%CO2)で細胞を24時間インキュベートします。必要に応じて下流工程(RNA抽出、タンパク質抽出、染色など)を行います。
注:siRNAのノックダウン時間と濃度は、個々の実験によって異なります。
2. O9-1細胞分化
- O9-1細胞の骨芽細胞への分化
- 骨形成分化培地を調製するには、以下をα-MEMで希釈します(最終濃度が示されています):0.1 μMデキサメタゾン、100 ng / mL骨形成タンパク質2(BMP2)、50 μg / mLアスコルビン酸、10 mM b-グリセロリン酸、10%FBS、100 U / mLペニシリン、および100 μg / mLストレプトマイシン。.
- 図1に示すように、分化した骨芽細胞中の骨芽細胞マーカーであるオステオカルシンを免疫染色により検出します。
注:骨形成分化は、骨芽細胞の他のマーカーを使用するか、アリザリン赤染色またはアルカリホスファターゼ染色を使用して評価することもできます。
- O9-1細胞の平滑筋細胞への分化
- 平滑筋細胞分化培地を調製するには、DMEMで以下を希釈します(最終濃度が示されています):100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン、および10% FBS。.
- 図2の例に示すように、平滑筋アクチン(SMA)などの平滑筋細胞のマーカーに対する抗体を使用して、免疫蛍光染色による平滑筋細胞の分化を評価します。
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結果
図1:骨芽細胞マーカーオステオカルシン(Ocn)の免疫蛍光染色により、O9-1細胞が骨分化条件下で骨芽細胞を生じさせたことを明らかにした。細胞を骨芽細胞マーカーOcn抗体(緑)で染色し、核をDAPI(青)で染色しました。矢印はOcn陽性細胞を示す。オステオカルシン(Ocn、骨芽細胞マーカー);DAPI(「6-ジアミジノ-2-フェニルインドール」)。
図 2:平滑筋アクチン(SMA)の免疫蛍光染色により、平滑筋細胞の分化条件下では、ほとんどの野生型O9-1細胞が平滑筋...
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開示事項
利益相反は宣言されていません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| O9-1マウス頭蓋神経堤細胞株 | ミリポアシグマ | SCC049 | |
| DMEM、高グルコース、グルタミンなし | ギブコ | 11960-044 | |
| DMEM, 高グルコース | ハイクロン | 01 SH30243日 | |
| FBS(ウシ胎児血清) | ミリポアシグマ | ES-009-B | |
| ペニシリン - ストレプトマイシン | ギブコ | 15140-122 | |
| L-グルタミン 200mM (100X) | ギブコ | 〒25030-081 | |
| HBSS中のトリプシン-EDTA 0.25% | ジェネシー・サイエンティフィック | 25〜510 | |
| DPBS(ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水)カルシウムまたはマグネシウムを含まない | ロンザ | 17-512階 | |
| MEM非必須アミノ酸(MEM NEAA)100X | ギブコ | 11140-050 | |
| ピルビン酸ナトリウム(100mM) | ギブコ | 11360-070 | |
| 2-メルカプトエタノール | シグマ | M-7522 | |
| 組換えヒト線維芽細胞成長因子-塩基性(rhFGF-basic) | R&Dシステム | 233-FB-025 | |
| マイトマイシンC | ロシュ | 10107409001 | |
| マトリゲル基底行列 | コーニング | 356234 | |
| DMSO(ジメチルスルホキシド) | ミリポアシグマ | MX1458-6 | |
| リポフェクタミン RNAiMAX | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 13778-075 | |
| Opti-MEM I (1倍) | ギブコ | 31985-070 | |
| 最小必須培地、α 1X とアール塩、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、L-グルタミン | コーニング | 10-022-履歴書 | |
| ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA | ダルマコン | L-041057 | |
| ON-TARGETplus ノンターゲティングプール | ダルマコン | D-001810 | |
| ON-TARGETplus Yap1 siRNA | ダルマコン | L-046247 | |
| FCS(子牛胎児血清) | |||
| ITS(インスリン-トランスフェリン-セレン) | |||
| TGF-B3 | |||
| アスコルビン酸 | |||
| BMP2(骨形成タンパク質2) | |||
| デキサメタゾン | |||
| B-27サプリメント |
