成体ヒト線維芽細胞由来の誘導神経前駆細胞コロニーの単離

要約

出典:Meyer, S. et al., Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells.J. Vis. Exp. (2015).

このビデオは、成体ヒト線維芽細胞由来の誘導神経前駆細胞(iNPC)を単離する技術を示しています。本稿では、iNPCコロニーを単離し、iNPC集団の継続的な増殖と拡大を促進する適切な培地の存在下で、ラミニン被覆マルチウェルプレートウェルで培養する手順を概説しています。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 推定誘導神経前駆細胞(iNPC)コロニーの単離

1. iNPCコロニーをピッキングする1日前に、48ウェルプレート1枚をラミニンでコーティングします:ラミニンをダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で1μg/mlに希釈し、溶液300μlをプレートに加え、4°Cで24時間保持します。1日後、プレートからラミニンを吸引し、200 μlの神経誘導培地(1:1 DMEM/F-12:Neurobasal、1x N2、1x B27、1% GlutaMAX、10 ng/mlヒト白血病阻害因子、3 μM CHIR99021、2 μM SB431542)をウェルに加えます。
2. 1回ピッキングするコロニーを含む6ウェルプレートをDPBSで洗浄し、6ウェルプレートのウェルごとに2mlの神経誘導培地を追加します。コロニーを機械的に選択します:細い針を使用してコロニーの周りをこすり、周囲の細胞を取り除きます。200 μLのピペットマンを50 μLにセットし、それぞれのピペットチップを使用してコロニーをピッキングします。
3. ラミニンでコーティングされた48ウェルプレートの1つのウェルにそれぞれ1つのコロニーを移し、ピペッティングを10回上下させることで、機械的にシングルセル懸濁液を生成します。ROCK阻害剤Y27632を最終濃度10 μMで細胞に添加します。
4. 48ウェルプレート上の細胞を37°C、5%CO₂で2日間増殖させます。細胞が80〜90%の密度に達するまで、2日おきに培地を交換します(約3〜4日)。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
CHIR99021	軸索メドケム	1386
DMEM F12	ライフテクノロジーズ	〒11320-033
DPBSの	ライフテクノロジーズ	14190から094
グルタマックス	ライフテクノロジーズ	〒35050-038
hLIF	ペプロテック	300から05
ラミニン	シグマ	L2020
N2	ライフテクノロジーズ	17502-048
神経基礎	ライフテクノロジーズ	21103-049
SB431542	インビボゲン	INH-SB43
27632円	カルバイオケム	CASの146986-50-7
B27	ライフテクノロジーズ	17504-044

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