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1. 高密度ニューロン培養のための24ウェルプレート調製
>注:胚の予定収穫の前日に次の手順(2-3)を実行してください。
- 2つの24ウェルプレートを細胞培養フードに持ち込み、個々のパッケージを開封します。
- 18 Gシリンジ針を1 mLのプラスチック製使い捨てシリンジに接続します。
- シリンジを持ち、針先をウェルの底の中央から左~1mmに向けます。適度な力(~250 g)を加えて、ウェルの底(長さ~1 mm)をエッチングします。溝が形成され、変位したプラスチック材料は、平らな底の井戸表面の上に高い支持体を形成します。同様に、底部の中心から右側に~1mmのところに、長さ~1mmの平行溝をもう一つエッチングします。
- 2 つの 24 ウェルプレートのすべてのウェルについて、この手順を繰り返します。高密度培養に使用した2枚の24ウェルプレートは、ポリ-D-リジンでコーティングする準備が整いました(以下のステップ2.8を参照)。
2. 低密度ニューロン培養のためのカバースリップ調製
- 直径12mmの#1丸ガラスを使用してください。
- 直径100mmの滅菌プラスチックペトリ皿に50枚のカバースリップを入れ、カバースリップを20mlの70%エタノール溶液に浸します。このペトリ皿を、中程度(70 rpm)の速度回転で回転するプラットフォームに1時間置きます。70%エタノールを取り出し、70%エタノールの新しいバッチと交換します。回転させてさらに1時間洗います。
- 70%エタノール洗浄液を廃棄します。滅菌水を加えます(0.2μmフィルターユニットでろ過)。カバーカバースリップを手で回転させて、カバースリップをしっかりとすすぎます。3回すすぎ、毎回新鮮な滅菌水と交換します。
- カバースリップ付きのペトリ皿を、層流のある無菌細胞培養フードの中に置きます。すすぎ水を真空ラインで吸引し、ろ過した滅菌水10mlを加えてカバーガラスを浸します。カバーガラスは滅菌済みで、表面はポリD-リジンコーティングに十分なほどきれいでなければなりません。
- 2つの24ウェルプレートを個別のパッキンから開き、フードに入れます。
- ボンネットのバキュームラインをオンにします。200μlのピペットチップをバキュームラインに接続し、ハサミでチップをカットして開口部を大きくします。
- 細い#5ピンセットを使用して、ペトリ皿からカバースリップを一度に1つずつピックアップし、バキュームラインを使用してカバースリップを完全に乾かします。次に、24ウェルプレートの各ウェルにカバースリップを1枚ずつ入れます。洗浄された50枚のカバースリップは、2つの24ウェルプレートの各ウェルを満たすのに十分であるはずです。
- ポリ-D-リジンストック溶液(1 mg/mL)をホウ酸緩衝液(pH 8.5)を含む作業溶液(0.1 mg/mL)に希釈します。4枚の24ウェルプレート(底部がエッチングされた高密度プレート2枚を含む)には、30 mLの総作業溶液を調製します。
- ガラスカバースリップで各ウェルに300 μl 0.1 mg/mlポリ-D-リジン作業溶液を添加します。カバースリップが溶液に完全に浸されていることを確認してください。そうでない場合は、#5ピンセットの先端を使用してカバーガラスをウェルの底に押し付け、先端を使用してポリD-リジン溶液をガイドしてカバーガラスのすべての表面を覆います。すべてのカバーガラスを目視検査して、プレートとカバーガラスの間に空気が溜まっていないことを確認します。
底部が- エッチングされた高密度培養プレートの各ウェルに300 μl 0.1 mg/ml poly-D-lysine作業溶液を加えます。手で回転させて溶液を広げ、ウェルの底全体を覆います。
- ポリD-リジンを含む4つのプレートすべてを培養インキュベーターに戻し、O / Nをインキュベートします。
>3. 培養プレートの洗浄とプレコンディショニング
>注:次の手順(3-5)は、組織採取の日に実行されます。
- カバースリップと24ウェルプレートO / Nのインキュベーション/コーティング後、4つのプレートすべて(ドナーカバースリップ付き2つ、エッチングプラスチック底付きアクセプター高密度プレート2つ)を培養フードに入れます。真空ラインを使用して、ポリ-D-リジン溶液を除去します。
- ポリ-D-リジン溶液を除去した直後に、プラスチック製のトランスファーピペットを使用して、各ウェルに~1 mLの滅菌水を加えます。すべての井戸が水で満たされたら、10分間放置します。真空で水を取り除き、各ウェルに300μlの洗浄培地を加えてウェルの底を覆います(ガラスカバースリップの有無にかかわらず)。ポリ-D-リジンコーティングを乾燥させないでください。
- 4つのプレートすべてをセルインキュベーターに戻します。分散した海馬ニューロンが準備されると、プレートを使用する準備が整います。
>4. ニューロンのプレーティングと長期共培養
- 高密度ニューロン用の底部がエッチングされた2つの24ウェルプレートを細胞培養フードに持ち込みます。300 μlのプレコンディショニング培地を真空で取り出します。0.6 mLの高密度細胞懸濁液を250,000ニューロン/mLでプレートします。
- カバースリップ付きの他の2つの24ウェルプレートを培養フードに持ち込み、300 μlのプレコンディショニング培地を真空で取り出します。0.6 mLの低密度細胞懸濁液を10,000ニューロン/mlで、2つの24ウェルプレート内のカバースリップにプレートします。
- 4つの24ウェルプレートをすべてインキュベーターに戻します。2時間座らせてください。
- ニューロンが付着した低密度カバースリップを高密度培養物に裏返します。ニューロンが互いに向き合っている(つまり、ガラスカバースリップで分離されていない)ことを確認します。次に、共培養した2つのプレートをインキュベーターに戻します。
5. 共文化の維持
- 300 μlの新鮮な飼料培地 (材料を参照) をin vitro (DIV) 5日目に添加して、共培養液を調製します。他の多くの研究で報告されているように、元の完全培地の50%を除去する必要はありません。また、給餌培地には15 μMのシトシンアラビノシド(Ara-C、最終濃度は5 μM)が含まれており、グリアの汚染と増殖の可能性を最小限に抑えます。
- この最初の給餌後、Ara-Cを含まない新鮮な飼料培地300μlを毎週ウェルに加えます。培養物を1か月以上保持する場合は、1か月の時点を超えて毎週、培地の半分を新鮮な飼料培地と交換します(最初の培地の半分はDIV33で交換します)。形態学的には、高密度ニューロンと低密度ニューロンの両方が最大3か月(実験者が観察した最長期間)までは健康に見えます。