人工神経前駆細胞のアストロサイトへの分化

要約

出典: Meyer, S., et al., Edenhofer, F. Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (2015年)

このビデオは、人工神経前駆細胞(iNPC)を特殊な培地を使用してニューロンとアストロサイトに分化するプロセスを示しています。

プロトコル

1. iNPCの差別化

1. 神経細胞の系統への分化
   1. 上記のようにラミニン被覆プレート上で細胞を培養する。細胞が約70%コンフルエントな場合、培地をニューロディファレンス培地(DMEM/F-12、1x N2、1x B27、300 ng/ml cAMP、200 μM ビタミンC、10 ng/ml BDNF、10 ng/ml GDNF)に変更します。3週間、1日おきにメディアを交換します。分化中に細胞を分割しないでください。
   2. 3週間後、細胞はニューロンマーカーTUJ1を発現するはずです。より成熟したニューロンとニューロンのサブタイプを獲得するには、最大3か月分化を続けます。
2. グリア系譜への分化
   1. グリア誘導培地(1:1 DMEM/F-12 : Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 10 μM β-mercaptoethanol, 100 μM non-essential amino acids, 1.5 mM L-Glutamine, 5 μg/ml insulin, 40 ng/ml T3) (20 ng/ml EGFを含む) に変更し、グリア前駆細胞への分化を誘導します。メディアの半分を取り外し、約2週間、1日おきに新しいメディアと交換します。この期間中、10 μM ROCK阻害剤Y27632の存在下で、100%のコンフルエントに達したときに細胞を1:3に分裂させる必要があります。
   2. 2週間後、細胞をさらにアストロサイトに分化させます:細胞がほぼコンフルエントになったら、培地を市販のアストロサイト培地に変更し、2日ごとに培地を交換します。約7日後、細胞はアストロサイトマーカー(GFAPなど)を発現し始めます。分化プロトコル中に細胞が100%コンフルエントになった場合は、10 μM ROCK阻害剤Y27632の存在下で細胞を1:2の比率で分割します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アストロサイト培地	サイエンセル	1801
B27	ライフテクノロジーズ	17504-044
BDNFの	ペプロテック	450から02
キャンプ	シグマ	A6885
DMEM	ライフテクノロジーズ	41966から029
DMEM F12	ライフテクノロジーズ	〒11320-033
DMSOの	ロス	4720
DPBSの	ライフテクノロジーズ	14190から094
EGFの	ライフテクノロジー	PHG0313
FCSの	バイオクロムAG	50115
GDNFの	ペプロテック	450から10
インスリン	セララボ	GEM-700-112-P
L-グルタミン	ライフテクノロジーズ	〒25030-024
ラミニン	シグマ	L2020
N2	ライフテクノロジーズ	17502-048
神経基礎	ライフテクノロジーズ	21103-049
非必須アミノ酸	ライフテクノロジーズ	11140-050
ビタミンC	シグマ	A4544の
β-メルカプトエタノール	ライフテクノロジーズ	21985023