マウス胚性幹細胞から神経前駆細胞を作製する技術

要約

出典:Mao, X., et al. In vitroでのマウス胚性幹細胞からのニューロン分化。J. Vis. Exp.(2020年)。

このビデオでは、マウス胚性幹細胞(mESC)から神経前駆細胞(NPC)をin vitroで作製する方法を実演しています。mESCは懸濁液中で培養して胚様体(EB)を形成し、その後、接着培養物中でレチノイン酸処理を介してNPCに分化するように誘導されます。

プロトコル

1. マウス胚性幹細胞培養

1. 0.1%ゼラチンでコーティングされた細胞培養皿またはプレートを調製します。
   1. 滅菌した0.1%ゼラチン(0.1%w/v水溶液)2 mLを60 mm細胞培養皿に加えます。細胞培養皿のコーティングを均一にするために、やさしく揺らします。
   2. ディッシュを37°Cの5%_CO2インキュベーターに入れ、1時間コーティングします。
   3. 細胞を播種する前に0.1%ゼラチン溶液を取り除きます.
      手記：ゼラチンを取り除いた後、コーティングされた食器を乾燥させたり洗ったりする必要はありません。
2. マウス胚性幹細胞(A2loxおよび129)培養
   1. mESC増殖培地のmESC増殖培地、37°C、0.1%ゼラチンコーティング60 mm細胞培養皿、5% CO₂インキュベーターでmESC(A2loxおよび129)細胞をそれぞれインキュベートします。mESC増殖培地は、85%ノックアウトダルベッコの修飾イーグル培地/栄養混合物F-12(DMEM/F12)、15%ノックアウト血清置換(KSR)、0.1 mM β-メルカプトエタノール(2ME)、2 mM GlutaMAX、1%非必須アミノ酸(NEAA)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(P / S)、1000 U / mL白血病抑制因子(LIF)、10 nM CHIR-99021(GSK-3阻害剤)および0.33 nM PD0325901(MEK阻害剤)で構成されています
      注意:β-メルカプトエタノールは可燃性であり、吸入毒性があります。火源から遠ざけ、使用時には吸入を避けるためにマスクを着用してください。
   2. A2loxおよび129のより良い成長のために、mESC成長培地を毎日交換してください。
   3. 細胞が80%のコンフルエントに達したら、培地を取り出し、1 mLの0.1%トリプシンを皿に加えます。30秒間穏やかに揺さぶり、すべての細胞にトリプシンを均一に覆います。
   4. 細胞を約1分間放置してトリプシン化し、1mLピペットを使用してトリプシンを除去します。
   5. 2 mLのmESC増殖培地を皿に加え、ピペットで数回上下させて単一細胞懸濁液を作製します。
   6. 血球計算盤を使用して、懸濁液中の細胞の密度をできるだけ正確にカウントします。
   7. 細胞を7つのグループに分け、表1に示すさまざまなプロトコルを使用して分化を誘導します。

2. mESCとNPCの区別

1. 0.1%ゼラチンでコーティングされた細胞培養プレートまたはカバースリップを調製します。
   1. 使用前に、ステップ1.1のように0.1%ゼラチンコーティングされた6ウェルプレートまたはカバースリップを準備します。
2. 差別化(表1)
   1. 1.5 x 10⁶ mESCを10 mLの基礎分化培地Iの非接着性細菌皿に添加し、5% CO₂インキュベーターで37°Cで胚様体形成を行います。
   2. 2日後、細胞凝集体を15 mLの遠心チューブに移し、重力で沈殿させます。
   3. 上清を取り除き、10 mLの新鮮な基底分化培地Iを加えて、胚体を再懸濁します。それらを新しい非粘着性の細菌皿に植え直し、さらに2日間分化させます。
   4. 顕微鏡下で胚様体の形成を確認します(図1A)。
   5. ステップ2.2.2-2.2.3で説明されているように、胚様体を収集します。ウェルあたり2 mLの基礎分化培地Iに約50個の胚様体を播種し、0.1%ゼラチンでコーティングした6ウェルプレートに播種します。
   6. 1 mMのオールトランスレチノイン酸(RA)ストック(DMSO中)を調製し、サブパッケージング後、-80°Cの冷凍庫で光を避けて保存します><。 手記：RAは不安定なため、RAストックの調製時には光から遠ざけ、空気との接触を減らすように注意する必要があります。
   7. RAインダクションでは、各ウェルに2 μLのRAストックを添加して、最終濃度を1 μMにします。
   8. プレートを37°Cの5% CO₂インキュベーターに入れ、さらに4日間分化します。
   9. 2 mL の基礎分化培地 I (1 μM RA を含む) 全体を 2 日ごとに交換します。

>表 1: 差別化で使用されるプロトコルの詳細。

議定書	メディア
4日間の胚様体形成+4日間のRA誘導	基礎分化培地: DMEM/F12 +15%FBS + 1%NEAA+0.1mM 2ME+ 1%P/S

結果

図1:胚様体の形態。 (A)胚様体を4日間培養した。(B)胚様体を2日間培養した。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
B-27サプリメント(50X)、無血清	ギブコ	17504044	-20°Cで保管し、光から保護します
CHIR-99021 (CT99021)	セレック	S1263	-20°Cで保存
カバースリップ	巣	801007
ウシ胎児血清	ハイクローン	03 SH30084月	-20°Cで保存し、凍結と解凍の繰り返しを避けてください
ゼラチン	ギブコ	CM0635B	室温で保存
GlutaMAX サプリメント	ギブコ	35050061	4°Cで保存
ノックアウトDMEM/F-12	ギブコ	12660012	4°Cで保存
ノックアウトセラムリプレイスメント	ギブコ	10828028	-20°Cで保存し、凍結と解凍の繰り返しを避けてください
MEM非必須アミノ酸溶液	ギブコ	11140076	4°Cで保存
N-2サプリメント(100X)	ギブコ	17502048	-20°Cで保管し、光から保護します
ニューロベースルミディアム	ギブコ	21103049	4°Cで保存
リン酸緩衝生理食塩水 (1X)	ハイクローン	SH30256.01B	4°Cで保存
ペニシリン/ストレプトマイシン溶液	ハイクローン	SV30010	4°Cで保存
PD0325901(ミルダメチニブ)	セレック	S1036	-20°Cで保存
レチノイン酸	シグマ	R2625	-80°Cで保管し、光から保護します
マウス胚性幹細胞 129	サイヤゲン	ミューエス-01001	フィーダーフリー培養システムで維持
トリプシン0.25%(1X)溶液	ハイクローン	01 SH30042月	4°Cで保存
2-メルカプトエタノール	ギブコ	21985023	4°Cで保管し、光から保護します
60 mm細胞培養ディッシュ	コーニング	430166
15ml遠心分離管	NUNCの	339650