神経前駆細胞のニューロンへの分化

要約

出典:Mao, X., et al. In vitroでのマウス胚性幹細胞からのニューロン分化。J. Vis. Exp. (2020年)。

このビデオでは、神経前駆細胞をニューロンに分化させる細胞培養方法を紹介しました。成長因子を補充した栄養豊富な培地で細胞をインキュベートすることにより、前駆細胞は発達した軸索と樹状突起を持つニューロンに成熟しました。安定化剤は、細胞の生存率を確保し、分化プロセス全体を通じて酸化的損傷から保護します。

プロトコル

>1. NPCからニューロンへの分化(フェーズII)

1. 0.1%ゼラチン被覆6ウェルプレートに、ウェルあたり2 mLの基礎分化培地I内の約5 x 10⁵マウス胚性幹細胞またはmESC誘導体を播種します。mESC誘導体を、Phase II protocol 1、protocol 2、protocol 3の3つのグループにランダムに分けます。
2. プレートを37°Cの5% CO₂インキュベーターに入れ、6時間接着します。2 mLのPBSで2回洗浄します。
3. 上記グループの各ウェルに、それぞれ2 mLの基礎分化培地I、N2B27培地I、およびN2B27培地II(表1)を添加します。
4. プレートをインキュベーターに入れ、さらに10日間分化させます。対応する媒体を2日ごとに交換します。
5. 分化状況を確認し、手順3で述べたように形態学的変化を記録します。
6. 18日目に、ニューロンの生成を評価します(β-Tubulin III陽性)ステップ4で使用した3つのプロトコルの分化効率を決定します。

結果

>表1:フェーズIIの差別化で使用される3つのプロトコルの詳細。

差別化フェーズII(10d)
	プロトコル	メディア
プロトコル1	自然に分化:基礎分化培地ではIのみ	基礎分化培地I:DMEM/F12 +15%FBS +1%NEAA +0.1mM 2ME+ 1%P/S
プロトコル2	N2B27培地Iとの鑑別	N2B27 ミディアム I: DMEM/F12 ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ウサギで産生された抗β-チューブリンIII抗体	シグマ・アルドリッチ	T2200	-80°Cで保存し、凍結と解凍の繰り返しを避けてください
B-27サプリメント(50X)、無血清	ギブコ	17504044	-20°Cで保管し、光から保護します
DME/F-12 1:1 (1個入り)	ハイクローン	SH30023.01B	4°Cで保存
ウシ胎児血清	ハイクローン	03 SH30084月	-20°Cで保存し、凍結と解凍の繰り返しを避けてください
蛍光顕微鏡	オリンポス	CKX53
ゼラチン	ギブコ	CM0635B	室温で保存
GlutaMAX サプリメント	ギブコ	35050061	4°Cで保存
イムノール染色一次抗体希釈バッファー	ビヨタイム	P0103	4°Cで保存
ノックアウトDMEM/F-12	ギブコ	12660012	4°Cで保存
MEM非必須アミノ酸溶液	ギブコ	11140076	4°Cで保存
N-2サプリメント(100X)	ギブコ	17502048	-20°Cで保管し、光から保護します
正常なヤギの血清	ジャクソン	005-000-121	-20°Cで保存
ニューロベースルミディアム	ギブコ	21103049	4°Cで保存
非粘着性バクテリアディッシュ	コーニング	3262
リン酸緩衝生理食塩水 (1X)	ハイクローン	SH30256.01B	4°Cで保存
ペニシリン/ストレプトマイシン溶液	ハイクローン	SV30010	4°Cで保存
PD0325901(ミルダメチニブ)	セレック	S1036	-20°Cで保存
レチノイン酸	シグマ	R2625	-80°Cで保管し、光から保護します
マウス胚性幹細胞 129	サイヤゲン	ミューエス-01001	フィーダーフリー培養システムで維持
2-メルカプトエタノール	ギブコ	21985023	4°Cで保管し、光から保護します
4%パラホルムアルデヒド	ビヨタイム	P0098	-20°Cで保存
6 - ウェルプレート	コーニング	3516
60 mm細胞培養ディッシュ	コーニング	430166
15ml遠心分離管	NUNCの	339650

名 株 名