感覚神経節からの細胞の単離

要約

出典:Kaelberer, M. M., et al. マウスの気道神経支配感覚ニューロンを標的にして分離する方法。 (2016年)。

このビデオは、マウスの感覚神経節からの細胞の分離を示しています。神経節は、細胞外マトリックスを溶解するために酵素消化を受けます。次に、細胞ストレーナーによるろ過により単一細胞を回収し、続いて密度勾配遠心分離を行い、デブリを除去します。最後に、洗浄と遠心分離を行い、分離された細胞を将来の分析のために収集します。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 感覚神経節の解離

1. 500 μlの神経節解離溶液(GaDS)をピペットで取り出し(表1)、神経節をチューブ内に残します。1 mlのリン酸緩衝液(PBS)を加えて神経節を一度洗浄し、神経節がチューブの底に落ち着くのを待ってから、PBSをピペットで取り出します。
2. 各チューブに1 mLのGaDSと22 μlの消化酵素 (コラゲナーゼI/IIとプロテアーゼミックス、2.5 mg/mlの水) を加えます。
3. 20 μl Fast Blue (5.26 mM) をポジティブコントロールチューブに加えます。
4. チューブを37°Cに設定されたウォーターバスまたは加熱ブロックに入れます。
5. 15分ごとに、チューブを短く振ってフリックし、神経節が溶液で覆われていることを確認します
   手記：神経節消化の時間は、消化酵素の年齢によって異なります。消化酵素を溶解してから1ヶ月以内に、30分間消化します。2〜6ヶ月以内に45分間消化します。酵素が6ヶ月以上経過している場合は、神経節を60分間消化します。
6. 神経節が消化されている間に、粒子溶液(ポリビニルピロリドンでコーティングされたコロイド状シリカ粒子)を使用して密度勾配を準備します。
7. 12%粒子溶液をGaDSに混合します(サンプルあたり500 μl)。
8. GaDSに28%粒子溶液を混合します(サンプルあたり500 μl)。
9. 各サンプルについて、新しい1.5 mLチューブに400 μl 28%密度溶液400 μLの12%密度溶液をゆっくりと慎重に加えます。2 つのレイヤーを混在させないでください。チューブ内には2つの異なる層が見え、一方が他方よりも暗くなっています。
10. 適切な消化時間の後、消化酵素でGaDSを除去し、1 mLのPBSで神経節を2回洗浄します。各チューブに200μlの新鮮なGaDSを加えます。
11. 200 μLのピペットを100 μLの容量に設定し、神経節を数回上下にピペットで動かして細胞をバラバラにします。無傷の組織片が見えなくなるまで繰り返します。溶液中に気泡を作らないようにしてください。
12. 解離した細胞を70μmのセルストレーナーに通します。
13. 元の解離チューブにさらに100 μl GaDSを添加して、残っている浮遊細胞をピックアップし、追加の溶液をセルストレーナに通します。新しいピペットチップを使用して、ストレーナを通過してメッシュに付着した残りの細胞含有液体を回収します。GaDSに懸濁した細胞の最終容量は300μlです。
14. 300 μlの細胞を、以前に作成した密度勾配の上に慎重に重ねます。気泡やセルと密度層の混合を避けてください。
15. RTで2,900 x gで10分間遠心分離します。
16. 遠心分離が完了したら、上部の700 μlの層を慎重に取り除いて廃棄します。この層には、細胞の選別を妨げる細胞破片の大部分が含まれています。
17. 700 μlの新鮮なGaDSを残りの溶液を含むセルに加え、数回上下にピペットで動かして混合します。
18. 18. 2,900 x gで15分間遠心分離し、細胞をペレット化します。
19. 19.遠心分離が完了したら、上清を慎重に取り除いて廃棄し、細胞ペレットを残します。
20. 200 μlにセットした1,000 μlピペットで数回ピペッティングして、細胞ペレットを200 - 300 μl GaDSに再懸濁します。サンプルを氷の上に置きます。

>表 1.神経節解離液(GaDS)用の試薬混合物。

成分	量
アドバンスドDMEM/f12	9.5ミリリットル
グルタミン	100μl
HEPES(10 mM)	100μl
N2サプリメント	100μl
B27(ビタミンAなし)	200μl
NGF(50μg/ml)	10 μl

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)CaおよびMgフリー	ギブコ	14190-144
アドバンスドDMEM/F12	ギブコ	〒12634-010
グルタミン(Glutamax)	ギブコ	35050-061
ヘープス	ギブコ	15630から080
N2	ギブコ	17502-048
B27(ビタミンAなし)	ギブコ	12587-010
神経成長因子(NGF)	シグマ	N6009	PBS/10% FBSに50μg/mlをストック
消化酵素、リベラーゼDH研究用グレード	ロシュ	5401054001	水に2.5 mg / mlをストック
粒子溶液(Percoll)	シグマ	1644-25ミリリットル
ヒーティングブロック	LabNet(ラボネット)
70 umセルストレーナー	隼	352350

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