げっ歯類の脳スライスの長期培養のための改質ローラーチューブ法

要約

出典:Fixman, B. B., et al. Modified Roller Tube Method for Precisely Localized and Repetitive Intermittent Imaging During Long-term Culture of Brain Slices in an Enclosed System. J. Vis. Exp. (2017).

このビデオは、げっ歯類モデルから脳スライスを長期培養するための修正ローラーチューブ法を示しています。まず、脳のスライスをカバースリップに取り付けます。次に、平らな面に穴が開いた平らな面のローラーチューブを取り、接着ディスクを使用してカバースリップを穴に配置します。最後に、栄養培地と二酸化炭素と空気の混合物をチューブに加え、チューブをローリングモーションでインキュベートします。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

>注:以下のプロトコルは、海馬スライスの長期インキュベーションと断続的なイメージングのための調製と培養方法を説明しています。1つの海馬スライスを、血漿凝固を使用して特別に調製されたフォトエッチングされたカバースリップに取り付け、次にカバースリップをドリルアウトされたローラーチューブの平らな面に密封し、ローラーインキュベーターで維持します。

1. ローラーチューブラックの準備

1. 図 1A に示すテンプレートを、スケール バーに示されているサイズに印刷して使用します。釘で、穴の中央にテンプレートに小さな穴(細かいポイントマーカーに十分な大きさ)を開けます。
2. 15 cmの組織培養皿(公称直径14 cm)の底にテンプレートをセットし、穴の位置に印を付けます。これを2皿目の皿で繰り返します。
3. プラスチックで使用するように設計されたドリルビットを使用して、各皿に直径1.5 cmの穴を6つ開け、皿の端から2.5 cmの穴の中心を六角形(中心から中心まで4.8 cm)にドリルします。図1Aに示すように、大きい穴のうちの2つの間に等距離に配置された端から12mmの3つの穴(直径3 mm)をドリルで開けます。
4. 各皿の底を向かい合わせにして、長さ2.5インチの小ネジ(直径3/16インチ)を小さな穴の1つに平ワッシャーで通し、続いて2番目の平ワッシャー、ポリエチレンチューブ(スペーサー、4.7 cm)、別の平ワッシャー、2番目の組織培養皿、別の平ワッシャー、ロッキングワッシャーを配置します。 そしてナット。
5. 他の2本の小ネジで手順1.4を繰り返し、すべての小ネジが所定の位置に収まるまで緩く締めます。次に、ナットをしっかりと締めます。
6. グロメット(厚さ5/16インチ、穴径5/8インチ)を底皿の穴に押し込み、最終的なローラーチューブラック(図1B、2本のチューブを所定の位置に示した状態)を取得します。各ラックに一意の番号のステッカーを貼ります。

2. ローラーチューブとカバースリップの準備

1. ローラーチューブに穴を開けるための治具を作る
   1. 1.5 x 2 x 4インチの木製ブロックの中央側に5.5cmの深さ1cmの穴を、ローラーチューブの平らな面が挿入時にブロックとほぼ平行になるように角度でドリルで開けます(図2A)。
   2. 丸い木のヤスリを使用して穴を広げ、穴を広げて先細りにし、チューブを挿入できるようにします(ローラーチューブはキャップ端付近の直径がわずかに大きくなります)(図2B)。
   3. ブロックの側面から5.5 cmのところに直径1.5 cmの垂直穴を開け、側面の穴の中央に穴を開けます(図2C)。
   4. サイドホールが十分に先細りになっている場合は、スライス用の穴の中央にマークされたローラーチューブを目的の場所に挿入し、マークされたスポットが1.5cmの垂直穴の中央にチューブを配置するようにします。
   5. チューブを取り外し、スポットからチューブの端までの距離を測定します。治具の穴の中心からこの距離をマークし、釘を挿入して、穴あけ用のチューブを正しく配置するためのストップを提供します(図2Cの矢印)。
   6. 弓のこを使用して、怪我を防ぐために、釘をウッドブロックの表面と同じ高さに切り取ります。
   7. ジグを固定できるスロット付きのドリルプレスがある場合は、ジグの下部にスプリングクリップを追加します(図2Dの黒い矢印)。それ以外の場合は、Cクランプを使用して治具をドリルプレスにしっかりと固定します。
2. 上記の治具を使用して、平らな面を上にして平らな面の11 cmのプラスチック培養チューブを保持して配置します(図2A)、中心が底から1.0 cmで、チューブの側面の中央に直径6 mmの穴を開けます
   手記： プラスチック用に設計されたドリルビットを使用する必要があります。
3. 回転式バリ取りツールを使用して、穴の端を滑らかにし(図2E)、穴の内側の端に4つの溝(図2E、挿入図)を作成して、回転中の穴の排水を容易にします。
4. 12mmの穴あけパンチで、無毒の両面接着シリコンゴムシートから直径12mmのディスクを切り取ります。標準の1穴ペーパーポンチ(直径6mm)を使用して、各ディスクの中央に穴を開けます。
5. ドリルで開けたチューブを70%エタノールですすぎ、生物学的安全キャビネットで風乾し、生物学的安全キャビネット内の紫外線(UV)ランプ(平均距離70cmで30W)の下でチューブとパンチされた接着ディスクを40分間滅菌します。
6. 20分後にチューブとディスクの位置を変えて、露出したすべての表面が滅菌されるようにします。無菌条件下で、接着ディスクから白い裏地をはがし、シリコンゴムをチューブの外側に貼り付けて穴を揃えます(図2F).
   注意：UVへの曝露を避けるために、UVランプをオンにする前に、目の保護具を着用し、キャビネットを閉じてください。
7. きれいな直径12 mmのフォトエッチング(中央に100の番号が付けられた1 mmの正方形)のドイツガラスカバースリップ。カバーガラスを鉗子でそっと保持し、無水エタノールに浸し、次に水に浸し、次に再び無水エタノールに浸し、最後にカバーガラスを炎に浸してエタノールを燃焼させます。カバースリップを冷まします。
8. 鉗子でカバーガラスを保持し、アセトン中の2%3-アミノプロピルトリエトキシシランに10秒間浸します。
9. カバースリップを生物学的安全キャビネット内の滅菌濾紙にセットし、UVライトをオンにします。カバースリップの両側を20分間露出させます.
   注意：UVへの曝露を避けるために、UVランプをオンにする前に、目の保護具を着用し、キャビネットを閉じてください。

3. 海馬スライスの準備

1. 解剖を開始する前に、ティッシュチョッパー用の両刃のカミソリの刃の半分を準備します。刃を指で縦に丁寧に折り、半分にスナップします。
2. 綿棒を使用してブレードの半分をアセトンですすぎ、きれいにした後、無水エタノールですすぎ、風乾します。ティッシュチョッパーにハーフブレードを取り付ける前に、70%エタノールですすいで滅菌してください。
3. イソフルラン麻酔後、生後4-7日のマウスまたはラットの子犬を首切りで安楽死させ、ハサミまたはギロチンで頭部を切除する
   手記：脳切片培養プロトコルは、マウスまたはラットの系統または遺伝子型に依存しません。異なる遺伝的背景を持つ多くのトランスジェニックマウス系統が使用されています。
4. 70%エタノールで頭をすすぎ、60mmのシャーレに入れます。ブレインスライスをローラーチューブに最終的に取り付けるまで、以下のすべてのステップは層流フードで行われ、無菌性を維持します。
5. #21サージカルブレードを使用して、皮膚と頭蓋骨を矢状に切り込みます。#5デュモン鉗子で、皮膚と頭蓋骨を剥がして脳を露出させます。
6. 閉じた鉗子で、脳全体を優しく引き出し、小脳の後ろの脳幹を通して鉗子でつまむことによって脳を解放します。4°CのGey's Balanced Salt Solution/0.5% glucose (GBSS/glucose)が入った滅菌済みの60 mm皿に脳を入れます。
7. 解剖顕微鏡を使用して脳を視覚化し(図3A)、脳の背側を上にして置き、脳の前部3分の1と小脳を手術用ブレードで切断します(図3B)。
   1. 鉗子を使用して、トリミングされた脳の後側を上にし、腹側をペトリ皿の側面に当てて安定させます。矢状正中線の周りの髄膜をやさしく取り除き、先端の細いデュモン#5鉗子(図3C、破線の円)を使用して中脳組織を取り除きます。
   2. 脳の側面に沿って2つの切り込みを入れて、脳を広げます(図3C、破線)。脳を背側を下にして広げると、海馬の裂傷が見えるはずです(図3D、矢印)。
   3. 広がった開いた脳をポリクロロトリフルオロエチレンプラスチックフィルムに移し、ティッシュチョッパーのステージ上でスライスするために配置します。ブレードをGBSS/グルコースで濡らし、海馬を~300μmの厚さに切り
   刻みます。
   4. トランスファーピペットを使用して、スライスした脳をプラスチックフィルムからGBSS/グルコースを含む新しい60 mmディッシュに洗い流します(図3E)。先端の細い鉗子で、スライス(図3G、H)から残りの髄膜と他の非海馬組織(図3F)をそっとつまんでからかいます。

4. めっきスライス

1. スライスが得られたら、準備したカバースリップのフォトエッチング面の中央に2 μLのチキンプラズマを置きます。プラズマをわずかに広げて、直径3〜4mmのスポットを実現します.
   手記：フォトエッチングされた面は、解剖顕微鏡で見たときのカバーガラスの上面であり、数字が正しく向き付けられています。
2. 滅菌した細い先端のへら(図4A)で1つの脳スライスを血漿スポット(図4B)に移します。閉じた鉗子を使用して、GBSS /グルコースからスライスを持ち上げながら、スライスをへらの先端に保ちます。
3. スパチュラをカバーガラスのプラズマスポットに触れ、閉じた鉗子でスライスをカバーガラスに押し込みます。.
4. 2.5 μL の血漿と 2.5 μL のトロンビンを別のチューブで混合します。この混合物2.5μLをスライスの上と周囲にすばやく置き、ピペットで優しく上下に動かして混合します(図4B).
   手記：プラズマは10〜15秒以内に凝固するため、これは迅速に行う必要があります。スライスの接着性に問題がある場合は、5 μLの血漿を5 μLのトロンビンと混合し、スライスに4〜5 μLを使用し、スライスがカバーガラス上に平らになるように混合後に一部を取り除きます。
5. ローラーチューブに貼り付けたシリコーンゴム接着剤の露出面から透明なプラスチックカバーをはがし、ブレインスライスの入ったカバースリップを穴内のスライスを位置合わせする接着剤に置きます(図4C)。
6. 密着性を確保するには、親指でカバーガラスを均等に押し下げ、約1分間保持しながら生物学的安全キャビネットに移し替えることで、カバーガラスに柔らかく均一な圧力をかけます。
7. 生物学的安全キャビネットで、0.8 mLの完全Neurobasal A培地(Table of Materials)を各チューブ(図4D)に加えます。
8. 5% CO₂/95% 空気混合物を、クランプでしっかりと保持された滅菌綿栓付きパスツールピペットに流します。ローラーチューブをガス混合物で洗い流し、ピペットの周囲からチューブを引き出すときにチューブをすばやくキャップします。
9. チューブにスライス番号とラック番号のラベルを付けます。チューブをローラーラックに挿入し、幾何学的にバランスが取れていることを確認します。チューブの数が奇数の場合は、バランスをとるためにチューブを追加します。
10. ローラーがローラーラックを約10〜13回転/時(RPH)で回転させる35°Cローラーインキュベーターにラックを置きます(図4E)。培地をチューブの底に保つには、インキュベーターをボード上で前面を上げて、インキュベーターを約5°後ろに傾けます。

結果

図 1: ローラーチューブラックの準備。(A)15cmの組織培養皿の底をドリルアウトするための穴の位置をマーキングするためのテンプレート。図が示されているスケールバーのサイズに印刷されている場合は、図を切り取って、示されている穴を開けるための15cmの培養皿上の位置に印を付けるために使用できます。(B)2本のチューブが挿入された完成したローラーチューブラック。各ラックには、ラックの上部に見やすいステッカーに番号が付けられています。

図 2:

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
15cmの文化食器からのボトムス	VWRサイエンティフィック	25384-326
プラス小ネジ(#10-32)	エースハードウェア		長さ2.5インチ、直径3/16インチ
平ワッシャー #10	エースハードウェア
小ネジナット(#10-32)	エースハードウェア
ラバーグロメット	エースハードウェア		5/16インチ、厚さ、5/8インチ、穴径、外径1.125インチ
ポリエチレンチューブ(5/16インチ;外径、3/16インチ;ID)	エースハードウェア		1.8インチの長さにカット
ロックワッシャー#10	エースハードウェア
ドリルプレス、5速	エースハードウェア
Nunclon Delta フラットサイド チューブ	VWRの	62407から076
ドリル・ビット、3 mm、6 mm、15 mm	エースハードウェア	ディアブロ・フロイト・ブランド	プラスチックを切断するためのドリルビット
ドリルビット、木材用、1.5 cmおよび1 mm	エースハードウェア
ウッドヤスリ、1/4 "ラウンド	エースハードウェア
スプリングクリップ、16mmスナップホルダー	エースハードウェア
スイベルヘッドバリ取りツール、5インチ	エースハードウェア	26307
粘着性シリコーンシート(セキュアシール)	グレースバイオラボ	666581	厚さ0.5mm
6mm穴あけパンチ	オフィスマックス
12mm穴あけパンチ	thepunchbunch.com
70%エタノール
Phototeched カバースリップ、直径 12 mm	ベルコグラス株式会社
ブンゼンバーナー
無水エタノール
ナノピュアウォーター
3-アミノプロピルトリエトキシラン	シグマ・アルドリッチ	A3648
アセトン	シグマ・アルドリッチ	179124
#5デュモン鉗子	ファインサイエンスツール	11251から30
マキルウェインティッシュチョッパー	テッド・ペラ社	10180
ダブルエッジカミソリブレード	テッド・ペラ社	121から6
Whatmanフィルターペーパー	VWRの	28450から182	直径5.8cmの円にカット
ポリ-クロロ-トリフルオロ-エチレン(Aclar)	テッド・ペラ社	10501-10	直径5.8cmの円にカット
#21 サージカルブレード	VWRサイエンティフィック	25860-144
#5デュモン鉗子	ファインサイエンスツール	11251から30
スパチュラ、ステンレス、先細り	VWRの	82027-518
Gey's Balanced Salt Solution(ゲイのバランスの取れたソルトソリューション)	シグマ・アルドリッチ	G9779
グルコース	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15023-021	25%(w / v)溶液、0.2 mmフィルター滅菌済み
チキンプラズマ	コカリコバイオロジカルズ	30-0300-5L	滅菌水で再水和し、2500 x g で 4 °C で 30 分間遠心分離し、アリコートを液体窒素で急速凍結して -80 °C で保存します。
トロンビン、局所(ウシ)	ファイザー	トロンビン-JMI	液体窒素中の急速凍結アリコートは、希釈剤中に1,000国際単位/mLで提供され、-80°Cで保存し、250単位/mLで使用します。
セルローラーシステム	ベルコバイオテック	サイエラ
ローラーインキュベーター	フォーマ	モデル3956

の の