1. マイクロ流体デバイスを用いた神経細胞培養の標準化:デバイス組立
- 目的の実験に適したマイクロ流体デバイスを選択します。同じ集団内のニューロンを接続するには、Neuro Devices(図1)を使用し、異なる集団のニューロンを接続するには、Co-Culture Devices(図2)を使用します。
- 必要な数の滅菌カバースリップまたはガラス底皿を清掃して準備します。プラスチック表面で最良の結果を得るには、35 mmの皿を使用し、ガラスには25 mmのカバーガラスまたは35 mmのガラス底の皿を使用します。イメージングシステムに基づいてガラスの厚さ(0.15 mmなど)を選択します。
- 皿またはカバースリップに0.5-1 mLの100 μg/mL PDLを2時間または室温で一晩塗布します
手記：プロトコルはここで一時停止し、必要に応じて翌日に再開できます。さらに、ディッシュは、ホウ酸緩衝液で希釈したPDL、ポリ-L-リジン(PLL)、ラミニン、またはその他の細胞接着分子でコーティングできます。
- 皿を水で2回洗い(塩の結晶がチャネルをブロックする可能性があるため、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を使用しないでください)、すべての液体を取り除き、バイオセーフティキャビネットなどの無菌環境で5〜10分間、または表面が完全に乾くまで乾燥させます
手記：カバースリップが完全に乾いていることを確認するように注意してください、残っている液体はマイクロ流体システムの接着を妨げるからです。
- 無菌環境(バイオセーフティキャビネット)にUV光の下で上を向いたパターンを持つマイクロ流体デバイスを10分間配置します。
- ピンセットを使用して、パターンが下を向いているマイクロ流体デバイスを、きれいなカバースリップ/ディッシュに接触させて配置します。ピンセットを使用して、デバイスがガラスに付着するようにデバイスをそっと押します。
手記： 付着した領域の透明度は、光に対して見たときに見えます。すべての角がガラスに接触していることを確認してください。これをすべてのマイクロ流体デバイスに行います。図 1a を参照してください。
- シングルポピュレーションデバイスを培地で満たすには、ピペットをチャネルに向け、無血清B-27(容量比1:50)と500μg/mLのペニシリン/ストレプトマイシン/グルタミン(総称してNBMと呼ぶ)を添加した50μLの全細胞培地を右上のウェルに加え、さらに50μLを斜めに横たわるウェルに加えます。これをすべてのデバイスに対して行い、培地がウェル間を流れることを確認します。次に、残りの2つのウェルに50μLの培地を加えます。 図 3a を参照してください。
- マルチポピュレーションデバイスに培地を充填するには、ピペットをチャネルに向け、30 μL の完全 NBM を右側のウェルに加えます(図 2a を参照)。これをすべてのデバイスに対して行い、培地がウェル間を流れることを確認します。次に、残りの4つのウェルに50μLの培地を加えます。
- オートクレーブ水(ウェットチャンバー)を入れたオープンディッシュで大きなプレートにデバイスを置き、インキュベーター(37°C、5%CO2、湿度95%)に1〜2時間置きながら、細胞培養を準備します。図 3b を参照してください。
2. マイクロ流体システムにおけるニューロンのめっき
- プロトコルに従って、Sprague Dawleyラット胚(性別)から解離した海馬ニューロンまたは皮質ニューロンを取得します。
- 胚性ニューロンをNBMに1〜200万ニューロン/mLの濃度で再懸濁します。顕微鏡で細胞濃度を血球計算盤と以下の参考文献8を使用して確認します。目的の細胞密度に応じて細胞濃度を調整します。チャネルごとに単一の海馬軸索を取得する可能性を高めるには、デバイスごとに10,000個のニューロンをプレート化します。同じチャネルに複数の軸索を持たせるには、デバイスごとに60,000個のニューロンをプレートします.
注:これらの数値は、使用するニューロンのタイプによって異なります。
- ウェルを空にせずに、マイクロ流体デバイスから培地を取り出します。それぞれに約5μLを残します。
- シングルポピュレーションデバイスで細胞をプレート化するには、50 μLのNBMを右下のウェルに加えます。この時点で、媒体はそれ自体で流れて、もう一方の下部ウェルを満たします。 図1bに示すように、20 μLの濃縮細胞溶液をマイクロ流体デバイスの右上のウェルに加えます。
- マルチプルポピュレーションデバイスで細胞をプレート化するには、図2aの右側の各ウェルに20 μLの濃縮細胞溶液を加えます。
- 細胞がチャンバー内にあるかどうかを顕微鏡で確認し、デバイスをインキュベーターに15〜30分間置いて、細胞の基質への付着を促進します。
- チャンバー内に十分な細胞があるかどうかを顕微鏡で確認してください。さらに必要な場合は、手順 2.4 と 2.5 を繰り返します。
- 50 μL の NBM を 1 つのポピュレーションデバイスの 2 つのトップウェルに加え、20 μL の NBM をマルチポピュレーションデバイスに注入した細胞と同じウェルに添加します。メディアはわずかに突き出ており、正の半月板を形成し、ウェルにマフィントップの側面を与えています。ここでも、図 3a を参照してください。
- セルを37°C、5%CO2、湿度95%に維持します。
3. 神経細胞の培養の維持
- NBM(ピペットで約30μL)を細胞から取り出し、デバイスに導入した翌日(つまり、ステップ2の1日後)に、事前に温めた新しいNBMを適用します。
- 各チャネルに十分なメディアがあるかどうかを 2 日ごとに確認してください。マフィントップが低い場合は、トップウェルにミディアムウェルを追加してください。
- マイクロ流体デバイスを取り外す前に、少なくとも7日間細胞を培養します。細胞はこれらのデバイス内で数週間生存することができます。サンプルで実験を行う1〜2日前にデバイスを取り外してください。
4. マイクロ流体デバイスの取り外し
- マイクロ流体デバイスを取り外す1〜2日前に、37°Cに予熱した2 mLのNBMを各サンプルディッシュに加え、チャンバーを浸水させ、デバイスをインキュベーターに維持します。
- 滅菌ピンセットと1つの先端を使用して、マイクロ流体デバイスをカバースリップから取り外し、ニューロンのパターン化された構成を残します。先端を使用してカバースリップを所定の位置に保持し、ピンセットを使用してウェルの左下隅にあるデバイスの端を留めます。丁寧にねじりを加え、ピンセットでデバイスを持ち上げてカバーガラスを剥がします。図 3c-3d を参照してください。
- 2〜3日ごとに、サンプルが実験に使用されるまでNBMの半分を交換します。
- サンプルの再配線実験を行う前に、顕微鏡でニューロン集団をつなぐフィラメントがないことを確認するために、顕微鏡でそれらの間のギャップを調べることにより、単一集団デバイスチャネルの神経突起と複数集団デバイスチャネルの神経細胞
集団が分離されていることを確認してください。
5. PDLコーティングビーズの準備
- 水(1:500)で希釈したポリスチレンビーズ4個、10μm、または20μmのポリスチレンビーズを50μL滴2個、PDL(100μg/mL)1mLに加えます。室温で少なくとも2時間放置します.
注:プロトコルはここで一時停止し、翌日に再開することができます。
- 溶液を8,820 x gで1分間遠心分離し、容器の底に蓄積したビーズを乱さないように上清を慎重に取り除きます。
- ビーズを1 mLの滅菌済み10 mM HEPES pH 8.4溶液で2回洗浄します。
- PDLコーティングしたビーズを200 mLの10 mM HEPES pH 8.4溶液に再懸濁します。
6. マイクロピペットの準備
- ガラスキャピラリーチューブ(内径1mm、外径1.5mm)から水平電極プーラーを使用してピペットを調製します。引っ張ったマイクロピペットの外側の先端が~2〜5μmになるように設定を調整します。引っ張る前に、ガラス管がきれいであることを確認してください。
- ピペットをスライドガラスに固定して保管し、先端が壊れやすいため、先端がスライドの表面に接触しないようにしてください。ほこりから保護するために、蓋付きの容器に室温で保管してください。ピペットは引っ張ったその日に使用してください。
7. PDLビーズのニューロンへの接着
- ステップ5で調製したPDLコーティングビーズ40-60μLを、ステップ4で調製した細胞培養物に加えます。ピペットの先端を、カバーガラスにかすかに見えるニューロンの中央に置き、ビーズを追加します(図4を参照)。
- サンプルをインキュベーターに1時間戻し、シナプス接触の形成を促進します。
- インキュベーション後、あらかじめ温めたNBMで培養物を優しく洗浄し、付着していないビーズを取り除きます。
8. 生理食塩水の調製(室温実験用)
- 生理食塩水を準備します。これは、インキュベーターの外側の細胞環境を調節するためです。
- 浸透圧とpHレベルを確認します。
- 実験中のpH変動を最小限に抑えるために、溶液にO2を連続的に注入します。
- 室温に加熱します。
- プラスチックチューブの一方の端(オプションの寸法)をO2注入した生理学的溶液に挿入し、もう一方の端をサンプルホルダーに挿入された針に固定することにより、灌流システムを設定します。チューブと溶液をサンプルよりも高い位置に置きます(図5を参照)。
- チューブを針から外し、シリンジに接続します。シリンジを使用して圧力をかけ、液体を引き出し、チューブを満たします。ローラークランプで密封し、針を再接続します。
9. ビーズのマイクロマニピュレーション
- マイクロマニピュレーターに取り付けられた2つのマイクロピペットで上から細胞にアクセスし、倒立光学顕微鏡の40倍相対物レンズ(開口数0.6)などを使用して、下から光学的にアクセスできるように、サンプルを実験装置に設置します。この構成では、画像キャプチャ用のCCDカメラを顕微鏡のサイドポートに取り付けます。プラスチックチューブを介して各ピペットを1mLシリンジに接続します。このステップでは、NBMを生理食塩水(1〜2 mL)に交換します(図5を参照)。
- 実験中、ステップ8で調製した生理食塩水で細胞を0.5〜1mL/minの速度で連続的に灌流します。
- 視野内のニューロンに結合していないPDLビーズを選択します。ビーズに焦点を合わせてからマイクロピペットまでピントを合わせ、ビーズをマイクロピペットの先端に合わせます。顕微鏡で監視することにより、先端をビードにできるだけ近づけます。
- ピペットに接続された1mLシリンジで負圧を加え、ビーズをピックアップします。実験中は陰圧を維持します。
10. 神経突起を引く
- 視野内のニューロンに付着したPDLビーズを選択し、ステップ9.3-9.4で説明したように吸引を使用して2つ目のマイクロピペットに取り付けます。
- PDL-ビーズ-ニューロン複合体をゆっくりと(~0.5 μm/分)引っ張り、マイクロマニピュレーターまたはサンプルステージを1 μm動かし、5分間一時停止して神経突起を開始します。
- 手順10.2を2回繰り返します.
注:実験の成功を保証するためには、最初の3μmを非常にゆっくりと引っ張る必要がありますが、これは95%以上の確率で発生します。
- PDL-ビーズ-ニューロン複合体をゆっくりと(~0.5 μm/分)引っ張り、マイクロマニピュレーターまたはサンプルステージを2 μm動かし、5分間一時停止して神経突起を伸ばします。
- 開始が成功し、最初の5μmの神経突起伸展が成功した後、ミリメートルスケールの距離で神経突起を20μm/minで引っ張ります
注:引っ張りは、連続的に、または段階的に、さまざまな速度で実行できます。図 6b-6c を参照してください。
11. ニューロンの接続
- 神経突起が豊富な領域を選択し、PDL-ビーズ-神経突起複合体を下げて、物理的に接触させます。他のビードを使用して、カバーガラス表面の上の先端の高さを測定します。図 6d を参照してください。
- PDL-ビーズ-神経突起複合体を標的神経突起に接触させたまま、2番目のマイクロピペットを操作します。新しく形成された神経突起の上に2番目のPDLビーズを載せた2番目のピペットを、最初のビーズから約20μm下げます。2つ目のPDLビーズを使用して、新しい神経突起フィラメントを標的細胞に押し込みます。
- 顕微鏡16で、焦点の腫脹、ビーズに接触する神経突起の肥厚がないことを確認します。
- この間、灌流を使用して、サンプルの培地を生理食塩水から予熱したCO2平衡NBMにゆっくりと変化させます。
- 吸引力を解放して、2番目のピペットからビーズを解放します。新しい神経突起が付着したままの場合は、最初のビードも放します。図 6e を参照してください。
- 生理食塩水を静かに取り除き、NBM(~2mL)と交換します。
- サンプルをインキュベーターに慎重に戻し、将来の実験のためにニューロンの接続を強化します。この接続は>24まで安定しています
