方法論記事

ヒト真皮線維芽細胞のリプログラミングによるニューロンの生成

2025年7月8日

この記事について

要約

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出典:Shrigley, S., et al. ヒト成体皮膚線維芽細胞からの誘導ニューロンの高収量培養の簡易生成。

このビデオは、成人のヒト皮膚線維芽細胞(aHDF)からのニューロンの生成を示しています。aHDFは、ニューロン転写因子とショートヘアピンRNA(shRNA)の遺伝子を運ぶレンチウイルスベクターを使用して再プログラムされます。shRNAはニューロンの転写抑制因子の発現を阻害し、ニューロンの転写因子は遺伝子を活性化してaHDFをニューロンに分化します。これらの再プログラムされたaHDFは、成熟したニューロンを生成するために、初期および後期のニューロン変換媒体で培養されます。

プロトコル

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>1. リプログラミングのための皮膚線維芽細胞の調製

  1. 自動細胞解凍システムまたは37°Cのウォーターバスを使用して、成人のヒト皮膚線維芽細胞(aHDF)を解凍し、T75フラスコあたり200,000をプレート化します(自動セルカウンターでカウント)10 mLの線維芽細胞培地(表1を参照)で、5%CO2中37°Cで
    2. 溶解します。
  2. 翌日、線維芽細胞培地で培地を完全に交換します。
  3. 細胞が95%の密度に達するまで、3〜4日ごとに線維芽細胞培地を交換します><。 手記：1つのコンフルエントフラスコには、約1,000,000個の細胞が含まれます。

2. リプログラミング用めっき (Day −1)

>注:短期実験(最大30日間)にはゼラチンコーティングを使用することをお勧めします。また、長期実験には、ポリ-L-オルニチン、フィブロネクチン、ラミニン(PFL)コーティングから始めることをお勧めします。

  1. リプログラミングのためにaHDFをプレーティングする60分前に、24ウェルプレートに0.1%ゼラチン(250 μL/ウェル)をコーティングし、37°Cでインキュベー
    2. トします。
  2. aHDF上で線維芽細胞培地を吸引します。ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で一度洗浄します。細胞を0.05%トリプシン(T75フラスコあたり1.5 mL)で37°Cで3〜5分間解離します。
  3. トリプシンを中和するために線維芽細胞培地を添加し(T75フラスコあたりフラッシュあたり3 mL)、フラスコ内の細胞を2回洗い流して、剥離した細胞を15 mLチューブに集めます。.
  4. 細胞を400 x gで5分間スピンダウンし、上清を捨て、細胞ペレットを1 mLの線維芽細胞培地に再懸濁します。
  5. 自動セルカウンターを使用して細胞をカウントします(トリパンブルー染色による細胞生存率が90%を超えていることを良好な品質の変換チェックで確認するため)。
  6. 完全な24ウェルプレートの場合、13.2 mLの線維芽細胞培地に1,320,000細胞の懸濁液を調製して、100,000細胞/mLの培地(または550 μLの線維芽細胞培地に55,000細胞/ウェルを必要なウェル数で乗算)の懸濁液を達成します。
  7. プレートからゼラチンを吸引し、DPBSで2回洗浄します。各ウェルに500 μLの細胞懸濁液を加え、5% CO2で37°Cで一晩インキュベートします。

3. ウイルス形質導入 (0日目)

>注:レンチウイルス粒子を扱うには、カテゴリー2の機器とウイルスを中和するための薬剤の使用が必要です。また、2組の手袋を着用することを強くお勧めします。

  1. 13.2 mLの線維芽細胞培地を37°Cに温めます。
  2. 転写因子achaete-scutファミリーbHLH転写因子1(Ascl1)およびBrn2を含むレンチウイルスベクターを、RE1サイレンシング転写因子(REST)を標的とする2つのショートヘアピンRNA(shRNA)で室温で解凍します。
  3. 形質導入エンハンサーを含まない培地に、感染の多重度(MOI)が20のaHDFに感染するために必要な量のレンチウイルスを追加します.
    figure-protocol-1
  4. 24ウェルプレートの培地をレンチウイルスベクターを含む線維芽細胞培地(500 μL/well)と交換し、5% CO2で37°Cで一晩インキュベートします。
  5. 翌日、ウェル内の培地をレンチウイルスベクターを含まない新鮮な線維芽細胞培地と交換します
    手記：培地は7日間感染性があると考えられるため、ウイルス形質導入後の最初の1週間は適切な保護と取り扱い手順を使用する必要があります。

4. 変換セルのメンテナンス

>注:変換が始まると、細胞は持ち上げられやすくなります。細胞が剥離しないように、培地を取り出すときはプレートを傾け、1,000μLのピペットを使用してください。

  1. 3日目に、線維芽細胞培地を取り出し、500μLの初期ニューロン変換培地を追加します(表1を参照)。
  2. 週に2〜3回、ウェルから225μLの古い培地を取り出し、250μLの新鮮な初期ニューロン変換培地を追加します。
  3. 18日目に、各ウェルからすべての培地を取り出し、500μLの後期神経変換培地と交換します(表1を参照)。
  4. 上記のように、25日目または実験エンドポイント(図1A)まで、2〜3日ごとに後期ニューロン変換培地を使用して培地の半分を交換し続けます。

表1. 使用されるさまざまな培地の組成。このプロトコルで必要な培地の組成の完全な説明には、線維芽細胞培地、初期ニューロン変換培地、後期ニューロン変換培地が含まれます。

型 の 型 の
ストック濃度作業集中力
線維芽細胞培地
基礎媒体該当なし該当なし
ペニシリン/ストレプトマイシン10,000 U/mL100 mg/mL
FBSの該当なし10%
初期神経細胞変換媒体(ENM)
神経分化媒体 該当なし該当なし
ペニシリン/ストレプトマイシン10,000 U/mL100 mg/mL
CHIR9902110 mM2 μM
SB-43154220 mM10 μM
頭100 μg/mL0.5 μg/mL
LDN-193118910 mM0.5 μM
VPAの1メートル1 mM
LM-22A420 mM2 μM
GDNFの20 μg/mL2 ng/mL
NT310 μg/mL10 ng/μL
dbのcAMP50 mM0.5 mM
後期神経細胞変換媒体(LNM)
神経分化媒体 該当なし該当なし
ペニシリン/ストレプトマイシン10,000 U/mL100 mg/mL
LM-22A420 mM2 μM
GDNFの20 μg/mL2 ng/mL
NT310 μg/mL10 ng/μL
dbのcAMP50 mM0.5 mM

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結果

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figure-results-1
図1:時間の経過に伴うiN変換の進化。(A)実験のタイムラインと、成体ヒトの真皮線維芽細胞を再プログラムするために使用されるレンチウイルスにパッケージされたコンストラクトのマップ。各黒の矢印は、中程度の変化を表します。(B)0日目から22日目までの変換プロセスにおける細胞の形態の変化を示す代表的な位相コントラスト画像(各パネルの右上隅に示されているように)。画像は、10倍対物レンズを使用して位相差顕微鏡で撮影されました。(C)形質導入後35日目のTAUとMAP2の二重染色の免疫蛍光画像。細胞を4%パラホルムアルデヒドに固定し、0.1%トリトンをDPBS中で10分間透過処理しました。細胞をDPBS中の5%血清溶液中で30分間ブロックしました。抗体をブロッキング溶液で希釈し、4°Cで一晩適用しました...

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開示事項

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利益相反は宣言されていません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
細胞株
成人ヒト真皮線維芽細胞[C2 passage #7] ドナーは67歳の女性でした。John van Geest Centre for Brain Repair(英国ケンブリッジ)のParkinson's Disease ResearchおよびHuntington's Disease clinicsから得られた細胞。
線維芽細胞の培養、形質導入、変換のための試薬
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)[-CaCl2、-MgCl2]ギブコ14190094
トリプシン-EDTA [0.5%]ギブコ15400-054DPBSで0.05%に希釈します。
Virkon(ウイルスを中和するために使用される薬剤)ビロダーム7511温水で1%溶液に希釈します。
ミリQウォーターミリポア
基礎ミディアム - ダルベッコ モディファイド イーグル ミディアム (DMEM) + GlutaMaxギブコ61965059
ペニシリン/ストレプトマイシン [10,000 U/mL]ギブコ15140-122
ウシ胎児血清(FBS)ギブコ10270-106
CryoMACS®ジメチルスルホキシド(DMSO)10ミルテニー〒170-076-303
神経分化培地 - NDiff 227タカラ・クロンテック40002円
LM-22A4トクリス460710 mg を 1450 μL DMSO.
で希釈します。 ストック濃度:20 mM
グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)[組換えヒト]研究開発体制212-GD-010DPBS中の500μL 0.1%BSAで10μgを希釈します。ストック濃度:20μg/mL。
NT3 [組換えヒト]研究開発体制267-N3-025DPBS中の2.5 mL 0.1% BSAで25 μgを希釈します。ストック濃度:10μg/mL。
dbのcAMPシグマ・アルドリッチD06271 g を 40.7 mL Milli-Q 水で希釈します.
500 μLのアリコートまたは10 mLのストックチューブをろ過して作製します。ストック濃度:50 mM
CHIR99021軸索13862 μg を 429.8 μL DMSO.
で希釈します。 ストック濃度:10 mM
LDN - 193189軸索15092 mg を 360 μL DMSO.
で希釈します。 ストック濃度:10 mM
バルプロ酸ナトリウム塩(VPA)メルクミリポア676380Milli-Q水で5 gを希釈し、ストック濃度を1 Mにします。注意: 摂取、皮膚との接触、および呼吸粉塵の形成を避けてください。
コーティング用試薬
ゼラチンシグマ・アルドリッチG2500Milli-Q水で0.1%に希釈します。
ポリ-L-オルニチンシグマ・アルドリッチP3655Milli-Q水に溶解します。15μg/mLでご使用ください。
フィブロネクチンサーモフィッシャーサイエンティフィック33010-0182 mLのMilli-Q水 + 70 μL 0.25 M NaOH。5 μg/mLでご使用ください。
ラミニンサーモフィッシャーサイエンティフィック23017-015-80°Cで保存し、氷上で解凍し、冷まして30μLを分注し、5μg/mLで使用してください。
備品
T75フラスコ [Nunclon Delta Surface]サーモフィッシャーサイエンティフィック156499
24ウェルプレート [Nunc]サーモフィッシャーサイエンティフィック142485
1.5 mLポリプロピレンチューブシグマ・アルドリッチZ336769
15 mLファルコンチューブザルシュテット6,25,54,502
50 mLファルコンチューブザルシュテット6,25,47,254
ピペットコントローラーピペッティング容量1〜25mLの場合。
滅菌血清ピペット:5、10、25 mLザルシュテット86.1253.001、86.1254.001、86.1685.001
容量可変ピペッター:5、20、200、1,000 μL
滅菌ピペットチップ0.5 - 1,000 μLのピペッティング容量用。
ThawSTAR自動細胞解凍システムバイオシジョンBCS-601
Countess II 自動セルカウンターサーモフィッシャーサイエンティフィックAMQAX1000
細胞計数チャンバー [スライド50枚] とトリパンブルー [0.4%]サーモフィッシャーサイエンティフィックC10228Countess II自動セルカウンターで使用します。
層流フード
加湿された5%CO2 37°Cインキュベーター
遠心機1、5、15、50mLのチューブに適しています。
オービタルシェーカー
倒立型蛍光顕微鏡ライカDMI6000 B
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