ヒト膠芽腫組織からのスライス培養物の生成と維持

要約

出典:Parker, J. J., et al.腫瘍細胞の移動と抗侵襲薬の患者特異的効果の研究のためのヒト神経膠芽腫器官型スライス培養モデル。J. Vis. Exp.(2017年)。

このビデオは、膠芽腫組織からの器官型スライス培養の生成と維持を示しています。単離された組織をアガロースマトリックスに包埋し、ビブラトームを用いて薄い切片を得る。次に、これらの切片をマイクロプレート内の透過性メンブレンインサートに配置し、スライス培養維持培地で培養して長期維持します。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. スライス前の準備

1. 「組織処理」培地と「スライス培養維持」培地は、予定されている腫瘍切除および組織採取の前日に調製します(または、以前に生成した培地を2週間以内に利用します)。5 mLのペニシリン-ストレプトマイシン溶液(10,000 U / mL)と5 mLの1 M 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)を500 mLの高グルコースダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)に加えて、組織処理培地を生成します。.
2. フェノールレッドを含まない神経細胞培地(例:Neurobasal)のベースを使用して、250 mLのスライス培養維持培地を調製します。この培地に 10 mM HEPES、1x B-27 サプリメント、400 μM L-グルタミン、600 μM L-アラニル-L-グルタミンジペプチド、60 U/mL ペニシリン、60 μg/mL ストレプトマイシン、および 6 U/mL ナイスタチンを補充します。
3. すべての培地は4°Cで2週間以内に保管してください。

>2. 手術当日:組織取得

1. 組織取得の日に、オートクレーブ滅菌されたガラス器具と層流フードの滅菌技術を使用して、組織処理媒体中の低融点アガロースの1%および2%(wt/vol %)溶液50〜100mLを調製します。腫瘍組織の一貫性の予測不可能な変動に対応するためには、両方の濃度のアガロースが必要です。
2. アガロース懸濁液を電子レンジを使用して、穏やかに沸騰するまで加熱します。アガロース溶液を37°Cのウォーターバスに入れ、使用するまで液体状態に保ちます。
3. 1 mLのスライス培養維持培地を6ウェルプレートの各ウェルに入れます。
4. 滅菌鉗子を使用して、空のポリテトラフルオロエチレン(PTFE)培養インサートを各ウェルに配置します。プレートを加湿したウォータージャケット付き組織培養インキュベーターに置き、5% CO₂雰囲気を37°Cに維持します。
5. 層流フードで滅菌パスツールピペットを使用して、腫瘍組織を取得する前に、95%O₂/5%CO₂ガスの混合物を氷冷組織処理培地を含むフラスコに約15〜30分間泡立てます。超酸素化培地の使用により、処理中のバルク組織の低酸素状態が最小限に抑えられます。
6. 手術室とスライス施設の間で組織を輸送するために、20 mLの超酸素化氷冷処理媒体のアリコートを含む標識された50 mLコニカルチューブ(個々の腫瘍領域を分離するのに十分な
数)を準備します。
7. 脳神経外科医と協力して、サンプル取得のための腫瘍領域を術前に計画します。患者の臨床画像 (T1 ガドリニウム後磁気共鳴画像法 (MRI) シーケンス) で示されているように、造影剤が増強された腫瘍領域を選択します。これまでの経験から、この領域は壊死組織とは対照的に生存可能な腫瘍組織をもたらすことが示唆されています
   手記：周囲の(腫瘍周囲の)白質からのスライスの生成が試みられました。しかし、バックグラウンドの自家蛍光と腫瘍細胞密度の低下により、これらのスライスの実験的有用性は制限されました。
8. 腫瘍切除の開始に向けて腫瘍組織を採取します。熱損傷に続発する組織の生存率を損なう可能性のある広範な双極性焼灼にさらされた腫瘍組織の収集は避けてください。.断片的な腫瘍切除中に取得された組織サンプルは、長時間の一括切除から取得された組織と比較した場合、生存率が高いことを示しています。この観察は、外科的切除の結果としての腫瘍組織の血流の差出せ、および取得までの時間が長くなることに関連している可能性があります。
9. 必要に応じて、腫瘍組織を標識して別々の円錐形チューブに保存し、異なる腫瘍領域からサンプルを分離します。(つまり、表在性腫瘍組織と深部腫瘍組織)。術中の外科的ナビゲーションが利用可能な場合、正確な組織位置を記録することができます。

3. スライス培養の準備

1. 腫瘍組織片を氷冷処理培地を入れたペトリ皿に入れます。腫瘍組織を洗浄し、付着した赤血球を最小限に抑えるには、ピペットを使用して、ペトリ皿内の培地を3回穏やかに交換および廃棄します。
2. メスを使って、腫瘍片を長方形の箱形に切ります。ティッシュペーパーを約3 mm x 3 mm x 10 mmにトリミングします。付着した血管を切除するか、細い鉗子で優しく牽引して慎重に取り除きます。
3. 37°Cのアガロース5〜7mLを小さな立方体(~^2cm3)のプラスチック埋め込み型にピペットで入れます。アガロース溶液の温度が37°C以下であることを滅菌温度計で確認してから使用してください。
4. アガロースを氷のベッドの上に約1分間置く。
5. 2〜4個の腫瘍組織を「ストリップ」して、長軸を垂直に向けるアガロースに配置します。手記：ティッシュストリップは、固化する前にアガロースに「沈む」傾向があります。この合併症を回避するには、アガロースがさらに固まるまで、組織ストリップを一時的に垂直に保持します。
6. アガロースカビを含む組織を氷のベッドに2〜5分間置いて、固化を促進します。
7. 氷からカビを取り除き、メスでフォームの側面を切ってアガロースブロックをそっと取り除きます。ブロックに過度の力を加えると、アガロースが破損する可能性があります。
8. シアノアクリレート接着剤をたっぷりと滴下して、アガロースブロックをビブラトーム試料プレートに貼り付けます。接着剤を約1〜2分間セットします。
9. ビブラトームリザーバーに氷冷処理媒体を充填し、試料プレートに貼り付けたアガロースブロックを沈めます。
10. スライス中に、トリミングされた滅菌プラスチックピペットを介してビブラトームリザーバーに95%O₂ / 5%CO₂ガス混合物を泡立てます。
11. ビブラトームスライスの厚さを300〜350μmに設定します。
12. 組織の一貫性に応じて、ブレードの前進速度とブレードの振幅を調整します。「硬い」膠芽腫組織では、ブレードの前進速度を遅くし、振幅を高くする必要があります。正確なブレード速度と振幅の設定は、ビブラトームの仕様によって異なります.
    手記：スライス中にいくつかの問題が一般的に発生します。組織ストリップがアガロースブロックから外れた場合は、高濃度のアガロースに組織を埋め込んでみてください。腫瘍スライスが希望よりも厚い場合(マシンセット)、または非対称の場合は、ビブラトームブレードの振幅を増やし、速度を下げます。腫瘍組織がブレードホルダーに付着したり、ブレードホルダーに「引きずられたり」しないように、スライスが発生したときに、ブレードが動くときにマイクロスパチュラをブレードホルダーとスライスの間に慎重に配置します。
13. ティッシュスライスを、ステンレス製のマイクロスパチュラを使用して、氷冷処理媒体でペトリ皿に移します。
14. PTFEインサートと平衡化スライス培養培地を含む6ウェルプレートをインキュベーターから入手します(セクション2、ステップ4で調製)。
15. ステンレス製のマイクロスパチュラを使用してティッシュスライスをプレートします。小さな細い毛の絵筆を使用して「流体波」を生成し、スライスをへらから培養インサートに優しく押し出すことにより、組織の直接接触と操作を最小限に抑えます><。 手記：組織培養インサートの上に導入するプロセッシング培地の量を最小限に抑えます。過剰な量の培地が移動し、スライスが浮遊する場合は、滅菌パスツールピペットを使用して培地を取り除きます。
16. 腫瘍切片を含む6ウェルプレートを、5%_CO2雰囲気で37°Cに維持されたインキュベーターに戻します
    手記： 埋め込みおよびスライスプロトコル全体は、手術室からの腫瘍組織取得から90分以内に完了する必要があります。

4. スライスカルチャーのメンテナンス

1. 12〜24時間後、滅菌鉗子で各インサートリムをつかんでスライス培養物を移し、新鮮なスライス培養維持培地を含むプレートに移します。各ウェルに分注したスライス培養維持培地がインキュベーター内で少なくとも15分間平衡化してから、インサートを移す前に確認してください。
2. インサートを新しい6ウェルプレートに移し、新鮮な平衡化スライス培養培地を48時間ごとに入れます。
3. 必要に応じて、古いスライス培養培地をピペットで分注してすぐに生化学アッセイに使用したり、将来の使用のために-80°Cで凍結します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM高グルコース	インビトジェン (Gibco)	11960-044
ニューロベースルAミディアム、マイナスフェノールレッド	インビトジェン (Gibco)	〒12349-015
B-27サプリメント(50個入り)、無血清	インビトジェン (Gibco)	17504-044
ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U / mL)	インビトジェン (Gibco)	15140-122
GlutaMAX サプリメント	インビトジェン (Gibco)	35050-061
L-グルタミン(200 mM)	インビトジェン (Gibco)	〒25030-081
HEPESの(1メートル)	インビトジェン (Gibco)	15630から080
ナイスタチンサスペンション	シグマ・アルドリッチ	N1638-20ミリリットル	10,000 unit/mL in DPBS、無菌処理、BioReagent、細胞培養に最適
UltraPure 低融点アガロース	インビトジェン (Gibco)	16520-050	65.5°Cで融解し、37°Cで流体のままで、25°C未満で急速に固まります。
Peel-A-Way 埋め込み型 (角型 - S22)	株式会社ポリサイエンス	18646A-1	腫瘍サンプル埋込用金型
ステンレス製マイクロスパチュラ	フィッシャーサイエンティフィック	S50823	スプーンブレードの首で器具を45度曲げ
湾曲したフィッシャーブランド解剖細細鉗子	フィッシャーサイエンティフィック	08-875
シングルエッジカミソリブレード(アメリカの安全カミソリ)	フィッシャーサイエンティフィック	17-989-001	ブレードエッジの厚さは0.009インチです。圧着された鈍いエッジカバーは、ビブラートにロードする前に取り外します。
ライカ VT1000 S ビブレーター	ライカバイオシステムズ	VT1000 S
親水性PTFE細胞培養インサート	EMDミリポア	PICM0RG50	30 mm、親水性PTFE、孔径0.4 μm
35mmガラス底皿	マテック	P35G-1.5-20-Cスリーブ	ガラス径20mm。カバーガラスの厚さ1.5 mm
PECON Stagetopインキュベーター	PeCONドイツ語	(販売終了)	インキュベーターPM 2000 RBTは、ツァイス顕微鏡で使用するために設計された優れた製品です。

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