ヒト血液脳関門の三重細胞培養モデルの開発

要約

出典:Fattakhov, N., et al. 虚血性脳卒中in vitroを研究するためのヒト血液脳関門のトリプル初代細胞培養モデル。 (2022年度)

このビデオは、人間の脳の周皮細胞、星状細胞、および内皮細胞の共培養を示しています。各細胞層は別々に形成され、次に一緒に培養され、血液脳関門の細胞配置を模倣した3層構造が形成され

ます

プロトコル

1. 三重細胞培養BBBモデルの設定

1. ペリサイト播種
   1. HBVP(ヒト脳血管周皮細胞)をT75培養フラスコで培養し、活性化表面を活性化して細胞接着を行います。これは、5% CO₂インキュベーター内で37°Cでコンフルエントになるまで行います。コンフルエンスに達したら、古い周皮細胞培地を吸引し、5 mLの温かいダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で細胞を洗浄します。DPBSを吸引し、4mLの温かいトリプシン-EDTA溶液と1mLのDPBS.
      の組み合わせを使用してフラスコから細胞を分離します。 注意: P7より後のパッセージは使用しないでください。
   2. フラスコを_CO2インキュベーターで37°Cで5分間インキュベートします。顕微鏡で観察し、細胞がフラスコから剥がれているかどうかを確認します。5 mLの温かい周皮細胞培地(2%ウシ胎児血清[FBS]を含む)をフラスコに加え、分離した細胞を50 mLの遠心チューブに移します。
   3. 細胞懸濁液を200 × gで3分間遠心分離し、細胞がチューブの底にペレットを形成するようにします。チューブから培地を吸引し、細胞ペレットが無傷のままであることを確認します。
   4. 細胞ペレットをペリサイト培地に再懸濁し、細胞のコンフルエンスと必要なウェルインサートの数に応じて培地の量を計算します。再懸濁した細胞を10μL取り、細胞計数スライドに入れ、細胞数をカウントします。
   5. 細胞密度を決定し、300,000細胞/インサートを1 mLのペリサイト培地にウェルインサート(6ウェルフォーマット)のアブルミナル側に播種します
      手記： インサートの下側にHBVPを播種するときは、ウェルインサートプレートを逆さまに裏返すことが重要です。プレートを表面に平らに置いた状態で、底部を取り外してウェルインサートのアブルミナル側を露出させます。蒸発を防ぐために、管腔側に周皮細胞懸濁液を追加した後、反転させたプレートでウェルインサートを覆います。すべてのプレートを逆さまにして、5% CO₂インキュベーターで37°Cで一晩保管します。
2. アストロサイトの播種
   1. 5% CO₂インキュベーター内のT75フラスコでHA(ヒトアストロサイト)を37°Cでコンフルエントに達するまで培養します。ペリサイト培地の代わりにアストロサイト培地(2%FBSも含む)を使用して、上記の手順1.1.1-1.1.4に従います
      注意: P9より後のパッセージは使用しないでください。
   2. 細胞密度を決定し、300,000個の細胞/ウェルを組織培養6ウェルプレートの底に播種します。蒸発を防ぐためにプレートを覆い、すべてのプレートを37°Cの5%_CO2インキュベーターに一晩保管します。
3. 内皮細胞の播種
   1. HBMEC(ヒト脳微小血管内皮細胞)を組織培養皿で、37°Cの5%_CO2インキュベーター内でコンフルエントになるまで培養します。ペリサイト培地の代わりに完全なクラシック培地(10%FBSを含む)を使用して、上記の手順1.1.1-1.1.4に従います。
      手記：P12より後のパッセージの使用は避けてください。
   2. アストロサイトを含む組織培養6ウェルプレートとペリサイトを含むウェルインサート(6ウェルフォーマット)を5% CO₂インキュベーターから37°Cで取り出します。各ウェルに1 mLのペリサイト培地と1 mLのアストロサイト培地を加えます。
   3. ウェルインサートから周皮細胞培地を吸引し、播種したアストロサイトを含む組織培養6ウェルプレートに入れます。HBMECを、2 mLの完全クラシック培地に300,000細胞/ウェルの密度で播種し、同じウェルインサートの頂端側に播種します
      手記： 内皮細胞は、ウェルインサートのアブルミナル側に周皮細胞を播種し、組織培養6ウェルプレートにアストロサイトを播種した後、翌日にウェルインサートの頂端側に播種する必要があります。細胞を6日間三重培養して、BBB様特性を誘導する必要があります。細胞培養培地は、実験の24時間前に両方のウェルインサートコンパートメントで交換する必要があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
24 mm トランズウェル、0.4 μm ポアポリエステルメンブレンインサート	コーニング	3450
35mmガラス底皿	MatTekライフサイエンス(FISHERSCI)	P35GC-1.5-14-C
アストロサイト培地	サイエンスセル	1801
アタッチメント係数	細胞システム(フィッシャーサイエンティフィック)	4Z0-201
セラムとCultureBoostを含むコンプリートクラシックミディアム	4Z0-500	細胞システム
Corning 50 mL PP遠心分離チューブ(CentriStarキャップ付き円錐底	VWRの	430829
コーニング 75cm² U字型 カンテッドネック 未処理 細胞培養フラスコ	コーニング	431464ユー
Corning CellBIND 96 ウェル フラット クリア ボトム ブラック ポリスチレン マイクロプレート	コーニング	3340
Countes Cell Counting Chamberスライド	サーモフィッシャーサイエンティフィック	C10228
Countess II FL 自動セルカウンター	サーモフィッシャーサイエンティフィック	ZGEXSCCOUNTESS2FL
DMEMミディアム(グルコースなし、グルタミンなし、フェノールレッドなし)	サーモフィッシャー	A14430-01	グルコースフリー培地
DPBS(カルシウム、マグネシウムなし)	サーモフィッシャー	14190250
EBM 内皮細胞増殖基礎培地、フェノールレッドフリー、500 mL	ロンザ	CC-3129
CO2インキュベーター
遠心機