マウス皮質アストロサイトの3Dバイオプリンティング法

1. ゼラチンメタクリロイル(GelMA)の合成

1. ブタの皮から採取したゼラチン10gを秤量し、溶液を240rpmおよび50°Cの加熱プレート上で完全に溶解するまで攪拌することにより、PBS100mLに溶解します。
2. フードの下に、2 mLのメタクリル無水物(MA)を加えて官能化度を低くし、ゼラチンエマルジョンを240 rpmおよび50°Cで2時間
   で攪拌します。 注意： MAハザードステートメント: H302 + H332(飲み込むか吸入すると有害)、H311(皮膚と接触すると有毒)、314(重度の皮膚火傷および眼の損傷を引き起こす)、315(皮膚刺激を引き起こす)、H317(アレルギー性皮膚反応を引き起こす可能性がある)、H318(深刻な眼の損傷を引き起こす)、331(吸入すると有毒)、H332(吸入すると有害)、H335(呼吸器刺激を引き起こす可能性がある)。取り扱いガイドライン:P261(ほこり/煙/ガス/ミスト/蒸気/スプレーの呼吸を避けてください)、P305 + P351 + P338 + P310(目に入った場合:水で数分間慎重にすすいでください。コンタクトレンズがある場合は取り外し、簡単に行うことができます。すすぎを続けます。すぐにポイズンセンター/医師に連絡してください)、P301 + P312 + P330(飲み込んだ場合:体調が悪いと感じた場合はポイズンセンター/医師に連絡してください。口をすすぐ).
   手記： MAを非常にゆっくりと、一滴ずつ追加します。
3. ゼラチン-MA溶液を予熱したPBS(50°C)100mLで希釈して最終容量200mLを取得し、溶液を240rpmおよび50°Cで10分間撹拌します。
4. 透析膜(分子カットオフ12-14kDa)を~20cmカットし、柔らかくなるまで脱イオン水に浸します
   手記：メンブレンに脱イオン水を入れて、穴や欠陥がないことを確認します。
5. 漏斗を使用して、ゼラチン-MA溶液をメンブレンに移します.
   手記：両側を閉じて、混合物を可能にするために内部に余分なスペースを残します。
6. ゼラチン-MA溶液を含むメンブレンを2Lの蒸留水を入れた容器に透析用に入れ、40°Cで5日間(500rpm)攪拌します
   手記： 水の蒸発を避けるために容器を覆います。
7. 蒸留水は1日2回交換してください。毎回、メンブレンを逆さまにして均質化します。
8. 5日目に、予熱した超純水200mL(40°C)を透析ゼラチン-MAと混合し、40°Cで15分間撹拌します。
9. ゼラチン-MA溶液を最大25 mLの50 mLコニカルチューブに移し、チューブを-80°Cで2日間放置します
   手記：凍結乾燥を容易にするために、チューブを水平に保管してください。
10. 凍結溶液を3〜5日間凍結乾燥し、凍結乾燥したGelMAを湿気から保護して保存します。

2. バイオインクの調製

>注:1 mLのバイオインクを得るためには、ろ過中に損失が発生する可能性があるため、少なくとも3 mLのバイオマテリアル溶液を製造することをお勧めします。

1. フィブリノーゲン溶液の調製
   1. 脱イオン水に生理食塩水(NaCl 0.9%)を調製し、ウシ血漿中のフィブリノーゲン10mgを生理食塩水1mLに溶解して、10mg/mLの濃度を得る
      手記：フィブリノーゲンはガラスに吸着するため、ガラスフラスコを使用してフィブリノーゲン溶液を調製しないでください。
   2. フィブリノーゲンが完全に溶解するまで、溶液を37°Cで撹拌したままにします
      注:フィブリノーゲンの溶解には、37°Cのオーブン内に配置された回転システムを使用し、37°Cのホットプレート上のフィブリノーゲンの磁気攪拌(180rpm)も適しています。この条件下では、10 mg/mL のフィブリノーゲンが溶解するまでに約 40 分かかります。
2. ゼラチン/GelMA溶液の調製
   1. 0.12 gのゼラチンを秤量し、1.9 mLの予熱したPBS(40°C)に加えて、最終濃度4%(w / v)ゼラチンを得ます。溶解を促進するためのボルテックス。
   2. 完全に溶解するまで、エマルジョンを40°Cに保ちます。
   3. 凍結乾燥GelMAを0.06g秤量し、ゼラチン溶液に移して最終濃度2%(w / v)GelMAを得ます。溶解を促進するためのボルテックス。
   4. 完全に溶解するまで溶液を40°Cに保ちます。

3. アストロサイト含有ゼラチン/GelMA/フィブリノーゲンバイオインクの調製

1. 10 mg/mL フィブリノーゲン溶液 0.9 mL をピペットで移動し、ゼラチン/GelMA 溶液に移して、最終濃度 3 mg/mL のフィブリノーゲンを得ます。
2. 0.015 gの光開始剤(PI)を秤量し、ゼラチン/GelMA/フィブリノーゲン溶液に移して、0.5%(w / v)PIの最終濃度を得ます。チューブを上下にひっくり返して溶液を混合し、PIの劣化を避けるために光から保護するために40°Cに保ちます.
   手記：バイオインクを4°Cで最大24時間ストックします。
3. 層流下で、0.2 μmフィルターを使用して溶液を滅菌済みの15 mLコニカルチューブにろ過します
   手記：生体材料溶液は、ろ過を可能にするために37〜40°Cである必要があります。
4. 980 μLの生体材料溶液を15 mLのコニカルチューブに移します。
5. ラミニンを生理食塩水で希釈して、100 μg/mLのストック溶液を得ます。
6. 20 μLのラミニンをピペットで移し、バイオインクの入ったチューブに移して、最終濃度2 μg/mLのラミニンを得ます。
7. ピペッティングで上下させて、泡を避けて穏やかに混ぜます。気泡が残る場合は、コニカルチューブを200 x gで2分間遠心分離します。バイオインクが細胞と混合されるまで、バイオインクを37°Cに保ちます。
8. 初代アストロサイトを0.05%トリプシンで5分間トリプシン化します.
   手記：継代1から3までのアストロサイトを使用します。
9. FBSでトリプシン活性を1:1の比率で中和し、細胞を15mLの円錐管に移します。200 x gで5分間遠心分離します。
10. 細胞を数え、1 x 106個の細胞を別の円錐管に移します。200 x gで5分間遠心分離します。
11. 上清を少量(~200 μL)残して細胞ペレットを懸濁させ、円錐管の底を軽くたたいて
取り除きます。
12. 1 mLのゼラチン/GelMA/フィブリノーゲン溶液を細胞を含むチューブに移し、ピペットで静かに上下させて均質化し、最終濃度1 x 10⁶細胞/mLを得ます。

3. 架橋剤溶液の調製

1. トロンビン再構成
   トロン
   1. ビン100 U/mLのストック溶液を滅菌脱イオン水に含み、0.1%(w / v)ウシ血清アルブミン(BSA)を15 mLコニカルチューブで調製します。-20°C.
      のマイクロチューブにストック 注:トロンビンはガラスに吸着するため、ガラスフラスコを使用してストック溶液を準備したり、アリコートを保管したりしないでください。
2. トロンビン-CaCl₂溶液の調製
   1. トロンビンストック溶液100 μLをピペットで移し、8.9 mLの滅菌脱イオン水が入った50 mLコニカルチューブに移して、最終濃度1 U/mLトロンビンを得ます。
   2. 脱イオン水に10%(w / v)CaCl₂溶液を調製し、0.2μmフィルターを使用して滅菌します。
   3. 10%CaCl₂溶液の1.1mLをトロンビンを含むコニカルチューブに移し、最終比1:9(CaCl₂とトロンビン)を得る
      手記：実験用の容量で架橋剤溶液を調製し、保管を避けます。

4. 押出成形バイオプリンターを用いたアストロサイト含有バイオインクのバイオプリンティング

1. 神経組織の設計
   1. Gコードを使用して、X軸とY軸の各バイオプリントライン間に1mm、Z軸に6層(各ライン間で0.2mm)の距離で6 x 6 mm(正方形)のグリッドを作成し、押し出し(E)を0.01 mmに設定し、Z軸の新しいレイヤーごとに0.001 mmずつ増やし、印刷速度(F)を400 mm / minに設定します(補足情報)。
2. バイオプリンターのセットアップ
   1. 機械をUVライトに15分間さらした後、エタノール70%で拭き取ります。
   2. 電源スイッチを使用してバイオプリンターの電源を入れます。USBケーブルでマシンをコンピューターに接続します。制御ソフトウェアを開いてバイオプリンターに接続し、ファイルデザインをロードします。
3. バイオプリンティングシリンジの調製
   1. アストロサイトを含むゼラチン/GelMA/フィブリノーゲンバイオインクを、1,000 μLピペットを使用して5 mLプラスチックシリンジに移します
      手記：気泡の形成を避けるためにゆっくりと移します。
   2. 滅菌済みの22Gの鈍い針をシリンジに接続します.
      手記：シリンジを4°Cで2分間放置します。
   3. シリンジをバイオプリンターのプリントヘッドに接続し、バイオインクを手動で洗い流して残りの気泡を取り除きます。
4. バイオプリンティング
   注:バイオプリントは層流フードの外側で行われました。
   1. バイオプリンターテーブルに35 mmの培養ディッシュを置き、針を培養ディッシュの表面から0.1 mm離して配置し、針が動くようにします。
      注:バイオプリンティングごとに35 mm培養ディッシュを1つずつ使用します。
   2. [印刷]ボタンを押します。
   3. バイオプリンティングが終了したら、シリンジが皿から離れることを確認します。次に、培養皿を閉じて、架橋プロセスの準備をします.
      手記：1つのコンストラクトのバイオプリンティングには、約1分10秒かかります。
5. バイオプリントされたコンストラクトと培養物の架橋
   1. 培養皿を2 mW/cm2のUV光下に2 x 60 s(上下)で置き、GelMA架橋を行います。
   2. 層流下で、滅菌ヘラを使用してバイオプリントされたコンストラクトを24ウェルプレートに移します。
   3. 500 μLのトロンビン/CaCl₂溶液を添加し、30分間放置してフィブリン架橋を行ないます。
   4. 架橋溶液を取り出し、コンストラクトを2 mLのPBS 1xで洗浄します。次に、PBSを1 mLのアストロサイト培養培地と交換し、37°Cおよび5%_CO2でインキュベートします。媒体は3日ごとに交換してください。