膠芽腫細胞の3次元培養のためのヒアルロン酸ベースのハイドロゲル

要約

出典:Xiao, W., et al. 患者由来の膠芽腫細胞の3次元培養のためのヒアルロン酸ベースのハイドロゲル。J. Vis. Exp. (2018年)。

このビデオは、脳腫瘍に由来する神経膠腫球が単一細胞に分離され、ヒアルロン酸ベースのハイドロゲルにカプセル化される様子を示しています。このプロセスにより、細胞間相互作用が促進され、構造化された三次元神経膠芽腫モデルが形成されます。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. ヒアルロン酸のチオール化

>注:モル比は、特に指定がない限り、カルボン酸基の総数に対して記載されています。

1. 500 mgのヒアルロン酸ナトリウム(HA、500-750 kDa)を10 mg / mLで脱イオン蒸留水(DiH₂O)にオートクレーブ滅菌した250 mL三角フラスコに溶解します。.溶液(~200rpm)を室温で2時間撹拌し、HAを完全に溶解する。攪拌子とマグネチック攪拌板を使用して、チオレーション手順中に反応を攪拌し続けます。
2. 0.1 M塩酸(HCl)を使用して、HA溶液のpHを5.5に調整します。1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)を69.6 mg(0.25倍モル比)で秤量します
   手記：未溶解のEDCはHA溶液に直接添加することもできますが、通常は最初にEDCを1 mLのDiH₂Oに溶解し、次にEDC溶液をHA溶液にすばやく加える方が簡単です。1 mLのDiH₂Oへの事前溶解は、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)およびシスタミンジヒドロクロロリドを使用して行うこともできます。その後、ステップ1.3および1.4で反応に添加します。
3. 反応に17.9 mg(0.125倍モル比)のNHSを添加します。.0.1 M HClを用いて反応液のpHを5.5に調整し、室温で45分間インキュベー
トします。
4. 70.0 mg(0.25倍モル比)のシスタミン二塩酸塩を反応溶液に加えます。.0.1 M水酸化ナトリウム(NaOH)を使用して、pHを6.25に調整します。反応物を室温で一晩、攪拌しながらインキュベートします。
5. 翌日、1 M NaOHを使用して、反応溶液のpHを約8に調整します。反応に192 mg(4倍モル比)のジチオスレイトール(DTT)を加えます。.DTTを添加した後、pHを8に戻し、室温で1〜2時間攪拌したままにします。
6. 1 M HClを使用してpHを4に調整します。反応混合物全体を予め浸した透析膜(分子量カットオフ値約13 kDa)に移し、pH 4.
   に予め調整したDiH₂Oに対して透析します。 手記：透析用のDiH₂Oの容量は、反応したHA溶液の容量の少なくとも40倍である必要があります(例:2 LのDiH₂O、pH 4に50 mLのサンプル
を充填)。
7. 透析液(DiH₂O、pH 4)を1日2回、室温で3日間交換します。
8. 透析溶液を0.22 μmのメンブレン真空駆動フィルターでろ過します。チオレートHAを液体窒素中で急速凍結した溶液です。凍結乾燥機を使用して、乾燥サンプルを2日間にわたって凍結します。チオール化HAは乾燥した状態で、-20°Cの真空シールデシケーターに少なくとも6ヶ月間保存できます。
9. チオロ化の程度を決定するには、エルマンの試験および/または陽子NMR分光法を使用します.
    

2. 架橋材料の準備

1. チオレートHAを所望の濃度(この例では13.3 mg/mL)でHEPES緩衝生理食塩水(Hank's balanced salt saline(HBSS)緩衝液中の20 mM HEPES、pH 8〜9以内に調整)琥珀色のバイアルに溶解し、周囲光への曝露を最小限に抑えます。溶液を常に攪拌し続けます.
   手記：HAに結合したチオール間のジスルフィド結合の形成は、pHが8を超える場合、溶液濃度が高すぎる場合、またはゲル化する前に溶液を長時間攪拌したままにしておくと発生する可能性があります。この問題を回避するには、チオレス HA を 15 mg/mL 未満で使用し、ヒドロゲルを生成してから 2 時間以内にチオル化ヒアルロン
酸を溶解してください。
2. 4-arm-PEG-maleimide (PEG-Mal, 20 kDa) および 4-arm-PEG-thiol (PEG-thiol, 20 kDa) をリン酸緩衝生理食塩水 (PBS, pH 7.4) に溶解し、50 mg/mL の PEG-Mal および PEG-thiol ストック溶液を調製します
   手記：PEG試薬を完全に溶解するには、少なくとも1時間かかります。
3. ECM由来ペプチドを添加する場合は、システイン含有ペプチドをPBSに溶解してストック溶液を調製します
   手記： 2〜4 mMのストック濃度を使用してください。
4. シリコーンゴム型をエタノールに少なくとも20分間浸して洗浄し、滅菌のためにオートクレーブします。

3. ハイドロゲル架橋と細胞カプセル化

>注:ここでの例として、0.5%(w / v)HAと1kPaの圧縮弾性率を持つ4つの個別の80μLヒドロゲルのカプセル化について説明します3。例えば、表1では、インテグリン結合ペプチドRGDを組み込んだ2つのハイドロゲルと、ペプチド活性のネガティブコントロールとしてシステインキャップを組み込んだ2つのハイドロゲルなど、さまざまな特性を持つハイドロゲルが得られるレシピを参照してください。患者由来GBM細胞の播種濃度は500,000細胞/mLです。

1. PEG-Mal原液(50 mg/mL、ステップ2.2)を12.5 mg/mLに希釈し、40 μLの原液を120 μL PBSに加えます。希釈した溶液を2本の1.5 mL微量遠心チューブ(それぞれ80 μL)に分割します。
2. 16 μL の RGD 原液 (2.8 mM、ステップ 2.3) を 1 本のチューブに加え、16 μL の原液システイン溶液 (2.8 mM、ステップ 2.3) を 2 本目のチューブに加えます。渦を混ぜます。ステップ3.9.
   で使用するまで、PEG-Mal-RGDまたはPEG-Mal-CYS溶液を氷上に置きます 手記：ここで説明する手順では、~140 μM のペプチドを含むハイドロゲルが得られます。これは、利用可能なPEGアームの約8本に1本がペプチドで占められていることに相当します。これは、システイン末端ペプチドの利用可能なマレイミド基に対するモル比を変更することで変化させることができます。一般に、最大濃度280 μMのペプチドを達成しながら、ハイドロゲル架橋に十分な数のマレイミド基を残すことができます。
3. PEG-チオール原液(50 mg/mL、ステップ2.2)を5 mg/mLに希釈し、50 mg/mL 原液 4 μL と PBS 36 μL を混合します。ステップ 2.1 で溶解したチオロール化 HA 120 μL を混合物に加えます
   手記：HMW HAの溶液は非常に粘性があります。したがって、溶液の移し替えには幅広のマイクロピペットチップを使用することをお勧めします。溶液がマイクロピペットチップの壁に付着するのを防ぎ、測定精度を向上させるために、ゆっくりとピペットを動かします。
4. 清潔で乾燥した型(ステップ2.4で調製)を、組織培養処理を施していない12ウェルプレートの各ウェルに入れます。ピペットチップの清潔で鈍い端を使用して、ゲル型を押し、型とウェルプレートの底部との間のシールを再確認します><。 手記： 液漏れ防止のため、封入直前に再度シールを確認してください。
5. 培養GBM細胞を継代し、単一細胞に解離し、前述のように細胞濃度を決定する3.
   手記：一部のGBMラインは、1つのセルに分離できません。この場合、神経膠腫球全体をカプセル化することができます。ただし、再現性を向上させるためには、正確な細胞計数後に解離した単一細胞を調製してください。神経膠腫球継代のプロトコールは研究室によって異なり、その多くはハイドロゲルカプセル化に適合している可能性があります。
   1. (推奨)神経膠腫球を500 x gで5分間遠心分離し、上清を取り除き、細胞ペレットに細胞解離酵素1 mLを加えます。その後、チューブを軽くたたいて撹拌しながら5分間インキュベートします。
   2. 4 mLの完全培地(50 ng/mL EGF、20 ng/mL FGF-2、25 μg/mLヘパリン、G21サプリメント、およびDMEM/F12中の1%ペニシリン/ストレプトマイシン)を細胞に加えます。
   3. 再度500 x gで5分間遠心分離し、上清を除去します。最後に、細胞ペレットを1 mLの完全培地に再懸濁し、懸濁した細胞を70 μmの細胞ストレーナーに通します。(推奨)ストレーナーを4 mLの完全培地で洗浄し、回収される細胞の数を最大化します。
6. 血球計算盤を使用して、懸濁液中の細胞の濃度を推定します。細胞懸濁液を2本の遠心分離チューブに分割し、各チューブには~80,000個の細胞が含まれています。500 x gで5分間遠心分離します。一般に、80,000個の細胞が2つの80μLハイドロゲルを構成します。
7. 上清を取り除き、1つのペレットを80 μLのPEG-MAL-RGD溶液に再懸濁し、もう1つのペレットを80 μLのPEG-MAL-CYS溶液(ステップ3.1で調製)に再懸濁します。
8. 200 μLのワイドオリフィスマイクロピペットチップを使用して、40 μLのHA溶液(上記のステップ3.3)を各ゴムシリコーンモールド(ステップ3.4で調製)に分注します。
9. 200 μLのワイドオリフィスマイクロピペットチップを使用して、40 μLのPEG-MAL-CYSまたはPEG-MAL-RGD細胞溶液を型内のHA溶液と混合します。ピペットですばやく上下するのは10回以下です。調製する各ゲル培養について繰り返します.
   手記：最初のステップは、最初のゲル化が迅速に(30秒以内に)行われるため、練習が必要です。ピペットを上下に動かしながら、チップを金型内のさまざまな場所に動かして、均一に混合できるようにします。気泡の形成を避けるために、常に先端を液面より下に保ちます。マイクロピペットの先端内部にゲルが形成される可能性があるため、溶液を何度も混合しないでください。PEG-MAL-CYSとPEG-MAL-RGDをさまざまな比率で組み合わせて、目的のRGDペプチド濃度を達成できます。
10. ゲルカプセル化された細胞を含むウェルプレートを37°Cの細胞培養インキュベーターに5〜10分間置き、反応が完了したことを確認します。
11. 形成されたゲルで各ウェルに2〜2.5mLの培地を加えます。滅菌済みの2 μLピペットチップまたはマイクロスパチュラを使用して、型とゲルを穏やかに分離します。滅菌済みの鉗子を使用して、ウェルプレートから型を取り除きます。ウェルプレートを細胞インキュベーター(37°Cおよび5%CO₂)に戻し、培養および将来の実験のために
    手記： ゲル培養物を傷つけないように、型を垂直に上に引っ張ります。一般に、ゲル培養液は3〜4日ごとに交換する必要があります。媒体を取り除くときは、ハイドロゲルを吸引しないように注意してください。これが問題になる場合は、プラスチック製のトランスファーピペットの使用をお勧めします。細胞数を追跡するための生物発光イメージングが計画されている場合、GBM細胞は、前述のように、カプセル化する前に構成的ルシフェラーゼ発現をコードするレンチウイルスで形質導入する必要があります3。生物発光イメージングでは、発光イメージングの1時間前に1 mMのD-ルシフェリンを培地に添加します。

結果

>表 1. HA濃度と機械的特性を独立して制御するハイドロゲル製剤。

ゲルタイプ	パートA(各40μL)			パートB(各40μL)
	4Arm-PEG-MAL (50mg/mL)	システインまたはRGD(2.81mM)	PBS(pH 7.4)	4Arm-PEG-チオール(50mg/mL)

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
pHメーター	サーモフィッシャー	該当なし	pH 2-10 の感度を持つ任意の pH メーター
攪拌板	サーモフィッシャー	該当なし	一般的なラボ機器
三角フラスコ (125mL)	サーモフィッシャー	FB-501-125
2Lポリプロピレンビーカー	サーモフィッシャー	S01916
HAナトリウム	ライフコア	HA700K-5	500-750 kDaの範囲
1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)	サーモフィッシャー	PI-22980
N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)	シグマ・アルドリッチ	130672から5G
塩酸(HCl)	サーモフィッシャー	サ48-500
水酸化ナトリウム(NaOH)	サーモフィッシャー	SS266-1
シスタミン二塩酸塩	サーモフィッシャー	AC111770250
ジチオールスレイトール(DTT)	サーモフィッシャー	BP172-25
エルマン試験試薬(5-(3-カルボキシ-4-ニトロフェニル)ジスルファニル-2-ニトロ安息香酸	シグマ・アルドリッチ	D218200-1G
重水素水(酸化重水素)	サーモフィッシャー	AC166301000
0.22μm真空駆動フィルター	セルトリート	229706
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	サーモフィッシャー	P32080-100T
ハンクスのバランスの取れた塩分塩水(HBSS)	サーモフィッシャー	MT-21-022-CV
4アーム-PEG-マレイミド	JenKemテクノロジー	A7029-1	分子量約20kDaの
4アーム-PEG-チオール	JenKemテクノロジー	A7039-1 (英語	分子量約20kDaの
L-システイン	シグマ・アルドリッチ	C7880-100G
RGD ECM模倣ペプチド	ジェンスクリプト・バイオテック	該当なし	配列「GCGYGRGDSPG」のカスタムペプチド、N末端はアセチル化する必要があります
シリコーンモールド	シグマ・アルドリッチ	GBL664201-25EA	カミソリの刃を使って一片に切る
完全培地	諸	諸	DMEM/F12(サーモフィッシャー)と非血清サプリメント(GeminiBioのG21)、上皮成長因子50ng/mL(Peprotech)、線維芽細胞成長因子20ng/mL(Pepro Tech)、ヘプリン25μg/mL(Sigma Aldrich)、培地は研究室によって異なります
患者由来のGBM細胞	該当なし	該当なし
プロテアーゼ/ホスファターゼ阻害剤ミニ錠	シグマ・アルドリッチ	5892970001
TrypLEエクスプレス	サーモフィッシャー	12604013
70μmセルストレーナー	サーモフィッシャー	22-363-548
細胞培養インキュベーター	サーモフィッシャー	該当なし	5%のCO2と37Cの一般のもの
冷蔵庫/冷凍庫	サーモフィッシャー	該当なし	-20°Cおよび-80°Cの容量を持つ一般的なラボ機器
使い捨て埋め込み金型	サーモフィッシャー	12-20
幅広オリフィスピペットチップ	サーモフィッシャー	9405120

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