器官型小脳スライス培養におけるプルキンエ細胞生存率の解析

要約

出典:Rakotomamonjy, J., et al.器官型小脳スライス培養におけるプルキンエ細胞の生存。 J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオは、マウスの子犬の脳から小脳器官型のスライスを取得し、栄養素と成長因子を添加した培地でスライスを培養して、in vitroで小脳の発達を模倣する技術を示しています。さらに、特定の小脳切片を試験化合物で処理し、免疫蛍光染色技術を用いて化合物の神経保護能力を分析します。

プロトコル

1. 器官型小脳スライス培養前の準備

1. 事前に70%エタノールを噴霧した細胞培養フードで、滅菌ボトルレシーバーに取り付けられた250mLのボトルトップ真空フィルターに200mLの培地を調製します。100 mLのBasal Medium Eagle(BME)、50 mLのHanks'Balanced Salt Solution(HBSS)、50 mLの熱不活化ウマ血清、1 mLの200 mM L-Glutamine(最終濃度1 mM)、および5 mLの200 g / Lグルコース(最終濃度5 mg / mL)を加えます。.培地を真空ろ過し、+4°Cで最大1ヶ月間保持します。
2. 滅菌されたバイオセーフティキャビネットで、パッケージから6ウェル培養プレートを取り出します。各ウェルに1 mLの培地を充填します。治療が試験される場合は、薬理学的物質を処理済みウェルに加え、コントロールウェルと同量のビヒクル溶液を添加します。本研究では、処理したウェルに1 μLの滅菌3 M KCl溶液(最終30 mM)を添加し、対照ウェルに1 μLの滅菌水を加えました。
3. 親水性ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)メンブレン(細孔径= 0.4 μm)で個別に包まれた細胞培養インサートを必要な数だけ細胞培養フード内に持ち込みます。慎重に包みを解き、滅菌鉗子で細胞培養インサートを取り出します。それらを1つずつ6ウェルプレートのウェルに滴下し、インサートメンブレンと細胞培養培地との間の界面で気泡が発生しないようにします。インサートを37°C、5%_CO2インキュベーター内の培地で少なくとも2時間平衡化してから培養します。
   手記：ティッシュチョッパーは、細胞培養フードに永久に常駐します。
4. 200 mLビーカーを2つ用意し、1つは150 mLの滅菌水で満たし、もう1つは150 mLの70%エタノールで満たします。手術器具を70%エタノール浴に浸し、次に水に浸してから使用してください
   手記：エタノールと接触した直後に手術器具を使用しないでください。.
5. 70%エタノールビーカーで両刃の刃を消毒します。滅菌鉗子を使用してブレードホルダーに置き、ブレードクランプレンチを使用して所定の位置に保持します。使用するまで乾かしてください。
6. ティッシュチョッパーに付属のプラスチックディスクを70%エタノールビーカーで消毒します。.ディスクをカッティングテーブルに置く前に、カッティングテーブルに70%エタノールをスプレーします。使用するまで乾かしてください。

2. 解剖と小脳器官型スライス培養

1. マウスの子犬を細胞培養フード内に持ち込んで解剖を行います。
2. まっすぐな操作ハサミを使用して、子犬をすばやく斬首します(図1A)。
3. まっすぐなドレッシング鉗子で子犬の頭を鼻で押さえながら、まっすぐなアイハサミを使用して、後端から正中線に向かって頭皮を切り開きます。
4. 頭蓋骨についても同じように進みます.
   手記：解剖中に小脳を傷つけないように、はさみの先端を外側に向けてください。
5. 脳を取り出し、冷たいHBSS + 5 mg / mLグルコースで満たされた60mmの皿に移します。
6. 滅菌したまっすぐな細い鉗子を使用して小脳を慎重に解剖します(図1B)。ティッシュチョッパーのカッティングテーブルに置かれたプラスチックディスクに、滅菌済みの湾曲した細い鉗子を使用して移します。
7. カッティングテーブルを回転させて組織の向きを合わせ、傍矢状切片を行います。
8. テーブルリリースノブを右に引いてカッティングテーブルを動かし、ブレードがティッシュの端にくるようにします。
9. スライスの厚さを350μmに、ブレードの速度を中程度に調整します。
10. チョッパーを始動します。小脳全体をスライスしたら(図1C)、チョッパーの電源を切ります。
11. 滅菌鉗子でプラスチックディスクを取り外します。
12. プラスチックディスクをHBSS + 5 mg / mLグルコースを含む60mmの皿に慎重に近づけます。.滅菌トランスファーピペットを使用して、冷たくしたHBSS + 5 mg / mLグルコースを組織にピペットで移し、緩衝液で満たされた皿の小脳スライスを収穫できるようにします。
13. マイクロプローブを使用して、小脳切片を互いに分離します。トランスファーピペットで良質な切片を取り出し(虫部に近い組織切片を使用することをお勧めします)、事前に平衡化した細胞培養インサートにドロップします(図1D)。
14. マイクロプローブを使用して小脳スライスを細胞培養インサートに配置し、トランスファーピペットで余分なHBSS + 5 mg / mLグルコース溶液を慎重に除去します><。 手記：この段階では、組織は非常に柔らかく、物理的な損傷を受けやすいです。細胞培養インサートあたりの小脳スライスの最大数は、ドナー動物の年齢によって異なります。P0〜P4齢の動物では6〜8スライス、P5歳以上の動物では4〜6スライスを培養できます。
15. 培養皿をインキュベーターに入れ、2〜3日ごとに培地を完全に交換します。
16. プルキンエ細胞の生存を評価するために、スライスはin vitroで5日という早い時期に収集できます。他の目的のために、それらは数週間培養中に維持することができます（図1F).
    手記：プルキンエ細胞生存実験の場合、細胞培養液を変更する際に薬理学的処理を更新する必要はありません(図1F)。

3. 免疫蛍光

1. インキュベーターから6ウェルプレートを取り出します。細胞培養培地を取り出し、細胞培養インサートを1x PBSで洗浄し、スライスを冷たい4%パラホルムアルデヒド溶液で1時間固定し、細胞培養インサートの下に1 mL、細胞培養インサートの上に500 μL
を浸します。
2. オービタルシェーカーで、インサートを1x PBSで10分間4回、インサートの下に1mL、インサートの上部に500μLで洗浄します。
3. ブラシを使用して、1細胞培養インサートから小脳スライスを、1x PBS、0.25% Triton X-100、および3% BSA(PBS-TB)、500 μL/ウェルをあらかじめ充填した24ウェルの1ウェルに移します。
4. PBS-TBで室温で1時間インキュベートすることにより、スライスを透過処理し、ブロックします。
5. PBS-TB溶液で希釈した一次抗体と、+4°Cで一晩、オービタルシェーカー(200 μL/well)でインキュベートします。
6. 翌日、1x PBSを用いて、500 μL/ウェルのオービタルシェーカーで10分間の洗浄を4回行います。
7. PBS-TB溶液で希釈した二次抗体と、室温で2時間、眼窩シェーカーでインキュベートし、光から保護した200 μL/ウェルでインキュベートします。
8. 1x PBSを用いて、500 μL/ウェルのオービタルシェーカーで10分間の洗浄を4回行います。
9. Hoechst 33342 を 1x PBS (2 μg/mL) で希釈し、室温で 10 分間、光から保護した 500 μL/ウェルでスライスを対比染色します。
10. 小脳スライスをトランスファーピペットで顕微鏡スライドに取り付けます。光から保護して、完全に風乾させます。1x PBSで再加湿し、数滴の封入剤(~80μL)で覆われたカバースリップを塗布します。泡を作らないようにしてください。
11. 封入剤が硬化すると、小脳切片をイメージングする準備が整います。

>4. 細胞生存のイメージングと定量化

1. メーカーに応じて顕微鏡とレーザーの電源を入れます。
2. 取得ソフトウェアを起動します。
3. 10X対物レンズを使用して、9〜10個の小葉(通常は虫部に近い小脳切片)を示す変化していない小脳スライスを見つけます。
4. z-stack acquisition をアクティブにします。小脳スライスに存在するすべてのプルキンエ細胞を含むように、zスタックの範囲を定義します。2μmのステップサイズを設定し、アクイジションを開始します。取得した画像を取得ソフトウェア製造元の形式で保存して、関連するメタデータを保持します。
5. 取得したファイルをImageJでBio-formatsプラグインを使用して開きます。
6. [Image > Stacks] > Z-project...に移動します(図2A)。
7. [Projection type] ドロップダウン メニューで [Max Intensity] を選択し、[OK] をクリックします (図 2B)。
8. フラット化された 2-D 画像が生成されます。マルチポイントツールをダブルクリックして、ポイントツールウィンドウを表示します。チェックを外します ラベルポイント カウントされたセルの視覚化を容易にするオプション。次に、プルキンエ細胞の体細胞を直接クリックしてカウントを開始します(図1E)。カウントされたセルの総数は、ポイントツールウィンドウの下部に表示されます(図3)
   手記：通常、細胞培養インサートあたり9〜10個の小葉を含む少なくとも3つの損傷していない切片を定量できます。薬理学的薬剤の神経保護効果を評価するには、少なくとも3つの独立した実験を実施する必要があります。.

結果

図1:解剖からプルキンエ細胞生存定量までのプロトコールの図。ネズミの子犬はすぐに首を切られます(A)。脳解剖後、小脳を分離し(B)、次に350μm幅のスライスに切り刻みます(C)。小脳切片をコントロールまたは処理した細胞培養インサート(D)に載せ、in vitroで少なくとも5日間培養に維持します。次に、組織を4%パラホルムアルデヒドに固定し、免疫染色を行い、共焦点顕微鏡で写真を取得します。最後に、ImageJ (E) の Multipoint Tool を使用して、各スライスのプルキンエ細胞数を定量化します。(F)培養中のKCl処理の時間経過の概略図。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Alexa Fluor 594 Donkey抗マウスIgG二次抗体	サーモフィッシャー サイエンティフィック	A21203の
ベイサルミディアムイーグル(BME)	サーモフィッシャー サイエンティフィック	21010046
バイオセーフティキャビネット Class II, Type A2	ヌアイレ	NU-540-400
ウシ血清アルブミン	ミリポアシグマ	A2153の
ブラシ
抗カルビンジンD-28K抗体 (CB-955)	アブカム	AB82812
CO2インキュベーター	ヌアイレ	NU-5700
Corning Costar フラットボトム 6 ウェル細胞培養プレート	フィッシャーサイエンティフィック	07-200-83
カバースリップ、22 x 50 mm	フィッシャーサイエンティフィック	12-545-E
ドレッシング鉗子、ストレート	ハーバード大学装置	〒72-8949
ダブルエッジブレード	フィッシャーサイエンティフィック	50949411
エタノール200プルーフ	デコンラボ株式会社	2701
アイハサミ、ストレート	ハーバード大学装置	〒72-8428
細い鉗子	フィッシャーサイエンティフィック	16*100*127
L-グルタミン100X	サーモフィッシャー サイエンティフィック	25030149
グルコース溶液	サーモフィッシャー サイエンティフィック	A2494001
ハンクスのバランスの取れた塩溶液	サーモフィッシャー サイエンティフィック	14025092
Hoechst 33342、三塩酸塩、三水和物	フィッシャーサイエンティフィック	H21492-J
ホースセラム、熱不活化、ニュージーランド産	サーモフィッシャー サイエンティフィック	26050088
イメージJ
マキルウェインティッシュチョッパー	フィッシャーサイエンティフィック	NC9914528
マイクロプローブ	フィッシャーサイエンティフィック	08-850
ミリセル細胞培養インサート	ミリポアシグマ	PICM0RG50
Nalgene Rapid-Flow 滅菌ディスポーザブルフィルターユニット(PES メンブレン付き)、250 mL	サーモフィッシャー サイエンティフィック	〒168-0045
ニコンA1R共焦点レーザー顕微鏡システム	ニコン
NIS-Elements イメージングソフトウェア	ニコン
パラホルムアルデヒド	アクロスオーガニックス	〒41678-0010
パスツールピペット	フィッシャーサイエンティフィック	13-678-20D
塩化カリウム	フィッシャーサイエンティフィック	BP366-500
ProLong Gold 退色防止マウンタント	サーモフィッシャー サイエンティフィック	ペ10144
操作ハサミ、ストレート	ハーバード大学装置	〒72-8403
オービタルシェーカーベリーダンサー	IBIサイエンティフィック	BDRLS0003
プリズム8	グラフパッド
Superfrost Plus 顕微鏡スライド	フィッシャーサイエンティフィック	12-550-15
ティッシュカルチャーディッシュ、60 mm、グリップリング付き	フィッシャーサイエンティフィック	FB012921
組織培養プレート、24ウェル	ファルコン/コーニング	353047
トランスファー・ピペット、滅菌済み	サーモフィッシャー サイエンティフィック	13-711-21
トリトンX-100	サーモフィッシャー サイエンティフィック	BP151-500

名