海馬組織サンプルからのニューロンの解離と培養

要約

出典:Servello, D. et al., A Microbiomechanical System for Studying Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons. J. Vis. Exp.(2018年)。

このビデオは、酵素的および機械的な解離を使用して、海馬組織サンプルからの海馬ニューロンの解離と培養を示しています。Ara-Cによる治療は、非ニューロン細胞の増殖を阻害し、海馬ニューロンの選択的増殖を促進します。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 妊娠中のマウス/ラットの海馬ニューロンの解剖、解離、培養

1. 培養のための海馬ニューロンの解剖と解離
   1. プロテアーゼ酵素溶液(3 mg/mL プロテアーゼ 23 in Slice dissection solution, SLDS, Table 1) と温めたプレーティング培地 (Table 2) を 37 °C で解凍します。
   2. 海馬を解剖し、SLDS.
      ですすいでください。 手記：4つの海馬は、1つの24ウェルプレートまたは1つの6ウェルプレートに十分な細胞を提供します。
   3. SLDSを取り外し、2 mLのプロテアーゼ酵素溶液を加え、サンプルを37°C、5%CO₂で15分間インキュベー
   トします。
   4. 海馬の外植片を5〜10mLのメッキ培地で2回洗います。めっき用培地5mLを加えます。海馬の外植片を1つの細胞に解離するには、1 mLのプラスチックチップを備えたピペットを使用して小さな渦を発生させます。溶液が濁り、大きな外植片が残らなくなるまで、酸素の泡の形成を避けながら、約40回ピペットで上下させます
      手記：洗浄中にいくつかの培地を残すことを忘れないでください、海馬の外植片は全過程を通して培地に沈めたままにする必要があります。
   5. 細胞を1,125 x gで3分間遠心分離し、細胞を培地に浸した状態で上清を除去します。細胞を145 mLのプレーティング培地に再懸濁します。細胞懸濁液1 mL/ウェルを24ウェルプレートに(3 mL/ウェルを6ウェルプレートに)加えます。
      注:145 mLのめっき培地を使用して、細胞密度の低い細胞懸濁液を作製します。このボリュームにより、実施する実験に応じて、細胞を6つの24ウェルプレート、8つの6ウェルプレート、または24ウェルプレートまたは6ウェルプレートのさまざまな組み合わせにプレーティングできます。24ウェルプレートの各ウェルには、約3 x 10⁴セルがあります。
   6. プレーティング培地中の細胞を37°C、5%CO₂で2〜4時間インキュベートし、その後、すべてのプレーティング培地を取り外して、新しいメンテナンス培地と交換します。
   7. 2日後(in vitroで2日、2DIV)、培地の半分を維持培地に溶解した2 μM Ara-C(アラビノシルシトシン)で置き換え、線維芽細胞、内皮細胞、およびグリア細胞の増殖を阻害します。細胞をAra-Cに2日間さらした後、培地を新しいメンテナンス培地と交換します。

表 1: カバースリップコーティング液。培養細胞をカバースリップに接着するために使用されるカバースリップコーティング液の調製レシピを提供します。

カバースリップコーティング液
780μL	酢酸17 mM ストック: 50 μL 酢酸 50 mL の H2O
200μL	ポリ-D-リジン(0.5 mg/mLストック)
20μL	ラットテールコラーゲン(3mg/mLストック)
総量は、コーティングするカバースリップの数に基づいて決定されます。

表 2: 細胞培養培地のレシピ。初代海馬ニューロン細胞の培養に利用される培地を調製するためのレシピを提供します。

1x スライス解剖液 (SLDS)、ろ過、pH = 7.4、4 °C で保存
1リットル	ddHの2O
82 mM	Na2SO4
30 mM	K2SO4
10 mM	HEPES(遊離酸)
10 mM	D-グルコース
5メートルメートル	MgCl2
0.00パーセント	フェノールレッド(オプション)
めっきメディア(PM、フィルター、4°Cで保存)
439ミリリットル	MEMアールの塩
50ミリリットル	FBSの
11.25ミリリットル	20%D-グルコース
5ミリリットル	ピルビン酸ナトリウム(100 mM)
62.5μL	L-グルタミン (200 mM)
5ミリリットル	ペニシリン/ストレプトマイシン (P/S, 100x)
メンテナンスメディア(MM、フィルター、4°Cで保存)
484ミリリットル	神経基礎
10ミリリットル	B27 50倍サプリメント
1.25ミリリットル	L-グルタミン (200 mM)
5ミリリットル	100倍P/秒
すべての溶液は、孔径0.2mmのフィルターを使用して滅菌されます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
12mmカバースリップ	ワーナー・インストゥルメンツ	〒64-0702	24ウェルプレート用
25 mmカバースリップ	フィッシャーサイエンティフィック	12-545-102	6ウェルプレート用
酢酸	フィッシャーサイエンティフィック	A38-212
ポリ-D-リジン	シグマ	P6407
ラットテールコラーゲン	ロシュ	11 179 179 001
PBSの10倍	ナショナル・ダイアグノスティックス	CL-253
Na2SO4	フィッシャーサイエンティフィック	S373-500
K2SO4	フィッシャーサイエンティフィック	P304-500
ヘープス	フィッシャーサイエンティフィック	BP410-500
D-グルコース	フィッシャーサイエンティフィック	D16-500
MgCl2	フィッシャーサイエンティフィック	BP214-500
NaOH	フィッシャーサイエンティフィック	SS255-1
プロテアーゼ酵素	シグマ	P4032
FBSの	ギブコ	26140
ピルビン酸ナトリウム	ギブコ	11360-070
L-グルタミン	ギブコ	25030081
ペニシリン/ストレプトマイシン100x(P / S)	ギブコ	15140122
MEMアールの塩	ギブコ	11090
B27サプリメント	ギブコ	17504-044
神経基礎	ギブコ	21103-049
アラビノシルシトシン(Ara-C)	シグマ	147*94-4
Opti-MEM メディア	ギブコ	31985-070

型 の