ヒト胚性幹細胞のオリゴデンドロサイトへの分化

要約

出典:Assetta, B., et al.ニューロン-オリゴデンドロサイト相互作用をモデル化するための多能性幹細胞からのヒトニューロンとオリゴデンドロサイトの生成。J. Vis. Exp (2020年).

このビデオは、ヒト胚性幹細胞からオリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)を生成し、続いてOPCがオリゴデンドロサイトに成熟するプロセスを示しています。このオリゴデンドロサイトの生成プロセスは、アルツハイマー病を含む神経変性疾患の研究と治療を改善するための多くの道を開きます。

プロトコル

1. 多能性幹細胞からのヒトオリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)の誘導とオリゴデンドロサイトの成熟

1. 神経前駆細胞(NPC)の生成:単層プロトコル(~7日)。フロー図については、図 1A を参照してください。
   1. 市販のH1ヒトES細胞を52の継代で使用してください(材料の表を参照)。ES細胞維持培地(材料表を参照)を使用して、細胞外マトリックス溶液でコーティングされた6ウェルプレート(6ウェルプレートあたり~0.5 mgのマトリックス溶液、材料表を参照)で細胞を培養し、プレートを5% CO₂で37°Cでインキュベー
   トします。
   2. デュアルSMADiと呼ばれる確立されたアプローチにより、細胞を神経前駆細胞(NPC)に分化させ、複数のシグナル伝達経路に対する低分子阻害剤を付与します。ここでは、広く受け入れられている市販のキットを使用し、メーカーが提供する単層プロトコルに従います(材料の表を参照)。
   3. -1日目に、成長因子低減マトリックス溶液(材料の表を参照)でコーティングされた6ウェルプレートに、ウェルあたり0.5–1 x 10⁶細胞をプレート化します(材料の表を参照)胚性幹細胞維持培地(材料の表を参照)でマトリックス溶液の~0.5 mg)。この成長因子低減マトリックス溶液は、次のステップで使用されるすべてのプレートをコーティングするために使用されます。
   4. 0日目に、2%ジメチルスルホキシド(DMSO)を添加したES細胞維持培地(材料の表を参照)で細胞を24時間処理します。
   5. 1〜6日目に、市販のキットからSMAD阻害剤を含む温かい(37°C)神経誘導培地でフルメディアを交換します(材料の表を参照)。7日目より前に細胞が分裂して合流点に達した場合は、ステップ1.1.3で前述したように、0.5–1 x 10⁶の播種密度に細胞を継ぎます。
   6. 7日目に、細胞剥離溶液(材料の表を参照)を使用し、播種密度1〜2×10⁵細胞/ウェルの24ウェルプレートでNPCを継代する。
   7. OCT4などの多能性マーカーの不存在、およびPAX6、Nestin、Sox1などのNPCマーカーの存在に対する免疫組織化学染色(IHC)による分化効率のアッセイ。
   8. この段階では、切り離されたNPCは、専用の商用NPC凍結培地(材料表を参照)で凍結し、液体窒素で最大3か月間保存できます。一度凍結融解した後も、NPCは信頼性の高いプロトコルでニューロン、アストロサイト、OPCを生じさせる多能性を保持しています。
2. オリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)の生成(~7日)。フロー図については、図1Aを参照してください。
   1. 7日目に、細胞剥離溶液(材料の表を参照)を使用してNPCを継代し、温かい(37°C)神経誘導培地と市販のキットのSMAD阻害剤(材料の表を参照)で、24ウェルプレートに1〜2 x 10⁵細胞/ウェルの播種密度でプレートします。
   2. 8日目に、OPC分化培地に1%DMSOの溶液を調製し、めっきNPCを24時間処理します。OPC 分化培地は、基礎培地(DMEM/F12)培地、1% N2 サプリメント、1% B27 サプリメント、20 ng/mL の塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、1 μM の平滑化アゴニスト(SAG)、10 ng/mL の血小板由来成長因子(PDGF-AA)で構成されています(材料表を参照)。
   3. 9日目に、DMSOを含まない新しいOPC分化培地に培地を交換します。15日目まで隔日で細胞に栄養を与えます。細胞が15日目より前にコンフルエントに達した場合は、ステップ1.2.1で説明したように、ウェルあたり1〜2 x 10⁵細胞の播種密度に細胞を継代します。
   4. 14日目に、OPC分化培地でOPCを1〜2 x 10⁵細胞/ウェルの密度で24ウェルプレートにプレート化します。
   5. この段階(15日目)では、免疫組織化学(IHC)染色または定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)によるOPC特異的マーカーの存在について細胞をテストします(例:O4、Olig1 / 2、CSPG4 / Ng2、NKX2.2、PDGFRa;図1B)NPCマーカー(Pax6またはNestin;図1D)。通常、15日目には95%以上の細胞でO4免疫反応性を検出します。アルツハイマー病と特に関連性があるのは、OPCにはAPP(アミロイド前駆体タンパク質)、BACE1(プロセシングプロテアーゼβ-セクレターゼ1)、ペプチドアミロイドβ(Aβ)の発現が豊富にあることです(図1F)。
3. オリゴデンドロサイト(OL)の成熟(~7〜20日)
   1. 15日目に、培地をOL成熟培地(Neurobasal-A培地、2%B27サプリメント、1 μM環状アデノシン一リン酸(cAMP)、200 ng/mL T3トリヨードチロニン、および1 μMのクレマスチン)と交換します(材料の表を参照)。必要に応じて、1日おきまたは毎日メディアを交換してください。
   2. 細胞のコンフルエンスが90%に達したら、1:3の比率で最大2継代まで分割するか、細胞分裂が大幅に遅くなるまで分割します。OPCの分裂が速すぎて3日以内にコンフルエントに達する場合は、Ara-C(材料表を参照)を2〜5μMの濃度で1〜3日間添加します。活発な増殖は、成熟効率の低下を示します。
   3. OLマーカー(CLDN11、PLP1、MBPなどの)の発現を評価することにより、オリゴデンドログリア成熟の効率をqPCR、IHC染色、または免疫ブロッティングによって調べます。非常に複雑な構造の特徴的な形態(図1C)とOLマーカーの発現(図1E)は、28日目までに容易に検出できるはずです。

結果

図1:iOPC(誘導オリゴデンドロサイト前駆細胞)の作製とiOL(誘導オリゴデンドロサイト)の成熟。 (A)iOPCとiOL生成のフロー図。(B)15日目のiOPCの代表的な明視野および免疫蛍光画像。Olig2(汎オリゴデンドロリアマーカー)は緑、O4(OPCマーカー)は赤、DAPIは青で示されています。イメージングにより、iOPCの>95%がO4陽性、25%がOlig2陽性であることが明らかになりました。(C)28日目のiOLの代表的な明視野および免疫蛍光画像。MBP は緑、O1 は赤、DAPI は青で示されます。(D)NPCマーカーPAX6の発現は、14日目にiOPCで劇的に減少し、28日目にOLでさらにバックグラウンドに低下し、iOPC集団における強...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アキュターゼ	STEMCELLテクノロジー	7920
B27サプリメント	サーモフィッシャー	17504044
bFGFの	サーモフィッシャー	PHG 0266
キャンプ	ミリポアシグマ	A9501
クレマスティン	ミリポアシグマ	SML0445
DMEM/F12 ミディアム	STEMCELLテクノロジー	36254
DMSOの	サーモフィッシャー	D12345
ウシ胎児血清	サイエンセル	10
H1ヒトES細胞	ウィセル	ワ01
マトリゲル	コーニング	354234
mTeSRプラス	STEMCELLテクノロジー	5825
N2サプリメント	サーモフィッシャー	17502001
神経基礎Aミディアム	サーモフィッシャー	〒10888-022
非必須アミノ酸	サーモフィッシャー	11140-050
PDGF-AA	R&Dシステム	221-AA-010
pMDLg/pRRE	アドジーン	12251
ポリブレン	ミリポアシグマ	TR-1003-G
pRSV-REVの	アドジーン	12253
ROCK阻害剤Y-27632	STEMCELLテクノロジー	72302
垂れる	トクリス	4366名
STEMdiff Neural Progenitor 凍結培地	STEMCELLテクノロジー	5838
STEMdiff SMADi ニューラルインダクションキット	STEMCELLテクノロジー	8581
T3トリヨードチロニン	ミリポアシグマ	T6397
Tempo-iOlogo:ヒトiPS細胞由来OPC	テンポバイオサイエンス	商品コード:102
TetO-NG2-ピューロ	アドジーン	52047
VSV-Gの	アドジーン	12259